弓形虫TgCtwh3和RH株调控宿主巨噬细胞凋亡的研究-病原生物学专业论文.docx

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1 中英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 Bcl-2 B-cell lymphoma-2 B淋巴细胞瘤-2 半 胱 天 冬 氨 酸 蛋 Caspase Cysteinyl aspartate specific proteinase 白酶 ERS Endoplasmic Reticulum Stress 内质网应激 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 FCM Flow Cytometry 流式细胞术 生长停滞及DNA损 CHOP/GADD Growth Arrest and DNA Damage gene  伤基因 GRA Dense Granule Protein 致密颗粒蛋白 MEF Mouse Embryonic Fibroblast 鼠成纤维细胞 NF-κB Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells  核转录因子 PBS Phosphate Buffer 磷酸盐缓冲液 PI Propidium Iodide 碘化丙啶 PV Parasitophorous Vacuole 纳虫泡 ROP Rhoptry Protein 棒状体蛋白 逆 转 录 多 聚 酶 链 RT-PCR Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction STAT Signal Transducer and Activator of Transcription  式反应 信 号 转 导 和 转 录 激活因子 TNF Tumor Necrosis Factor 肿瘤坏死因子 肿 瘤 坏 死 因 子 受 TNFR Tumor Necrosis Factor Receptor 体 弓形虫 TgCtwh3 和 RH 株调控宿主巨噬细胞凋亡的研 究 硕士研究生 莫绪维 导 师 沈继龙教授 （安徽医科大学病原生物学教研室；安徽病原生物学省级实验室； 人兽共患病安徽省重点实验室） 中文摘要 背景 弓形虫是一种专性寄生于有核细胞内的顶复门原虫，具有机会致病性。猫科 动物为其终宿主，中间宿主为包括人在内的几乎所有温血动物。已知北美和欧洲 的弓形虫基因型主要为 I、II 和 III 型；我国的优势基因型为 Chinese 1 型。大量研 究证实，弓形虫通过抑制宿主细胞的凋亡在宿主体内建立广泛而有效的感染，维 持自身的生存与繁殖。目前，针对弓形虫调控宿主细胞凋亡机制的研究主要集中 于死亡受体和线粒体两个经典凋亡途径，而关于内质网应激途径的相关研究较少。 此外，研究的虫株多为 I 型的 RH 强毒株，而针对我国流行的优势基因型 Chinese 1 型（TgCtwh3，强毒株）调控宿主细胞凋亡的研究较为罕见。 目的 观察感染弓形虫两种分离株（TgCtwh3 和 RH）的巨噬细胞（Raw264.7）凋 亡，观察各种凋亡相关因子的转录表达，旨在探讨我国流行的弓形虫 TgCtwh3 株 与 I 型的 RH 株调控宿主细胞凋亡机制的差异，以期为我国弓形虫病的防治提供理 论与实验依据。 方法 1）将研究对象分为 3 组：正常对照组、TgCtwh3 感染组和 RH 感染组，分 别给予凋亡诱导剂星状孢子素（staurosporine）处理，通过流式细胞术检测 3 组巨 噬细胞的凋亡；2）应用 qRT-PCR 检测 3 组细胞的促凋亡家族成员（Bax，Bad）、 抗凋亡家族成员（Bcl-2，Bcl-xl），内质网应激标志物 CHOP 的转录水平；3）应用 Western blotting 检测 3 组巨噬细胞的促凋亡蛋白（Bax，Bad）、抗凋亡蛋白（Bcl-2， Bcl-xl）、内质网应激标志物 CHOP 以及凋亡关键酶 Caspase 9 的蛋白表达水平。 结果 1）感染组巨噬细胞早期凋亡率较正常对照均明显下降。2）qRT-PCR 结果显 示，感染组 Bcl-2，Bcl-xl 及 CHOP 的转录水平均明显升高，Bax 和 Bad 的转录水 平无明显变化。此外，TgCtwh3 组的 Bcl-xl 转录水平明显高于 RH 组，而两组的 Bcl-2 转录水平无明显差异。3）Western Blot 结果显示，感染组巨噬细胞的 Bcl-2， Bcl-xl 及 CHOP 蛋白表达水平均显著升高，Bax 和 Bad 的蛋白表达水平无明显变化。 其中，TgCtwh3 组的 Bcl-xl 蛋白表达水平明显高于 RH 感染组，而两组的 Bcl-2 的 蛋白表达水平无明显差异。 结论 在弓形虫感染早期阶段，TgCtwh3 和 RH 分离株通过上调 Bcl-2，Bcl-xl 的表