粪肠球菌感染根管形成根尖生物膜及根管预备对其影响的体外研究-口腔医学专业论文.docxVIP

重庆医科 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 Ef 英文全称 Enterococcus faecalis 中文全称 粪肠球菌 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 d Day 天 min Minute 分钟 TAE Tris-acetic acid and EDTA buffer 乙二胺四乙酸缓冲液 PED Post-treatment endodontic disease 根管治疗后疾病 SEM Scanning Electronic Microscope 扫描电镜 1 体外模型中粪肠球菌感染根管形成根尖周生物膜及根 管预备对其影响的研究1 摘 要 在口腔细菌学研究发展愈加前沿以来，国内外大量学者研究表明 根尖周炎的发病来源中最重要的是细菌的影响[1]。而细菌生物膜由依靠 胞外产物（如多糖及蛋白质）而粘附于固体表面的细菌群落组成。细 菌生物膜能够通过结合有机和无机成分，形成稳定的生物群落从而产 生相互影响及作用[2]。因此，从细菌学的角度看，生物膜为细菌提供了 一个稳定的生存环境，起到了屏障作用以及占位性保护作用，从而使 细菌不那么容易被破坏，以此显著提高细菌的生存能力及外界抵抗力[3, 4]。现阶段，关于牙体牙髓疾病和牙周病中的细菌生物膜的实验，大多 数为根管里面的生物膜以及牙颈部和牙齿表面的菌斑生物膜[5, 6]。但是 由于根尖及牙周的组织和细菌难以取材，因此对于感染根管形成根尖 周炎和根尖生物膜的原因尚未完全明了。Plakunov研究发现：当有外界 刺激干扰感染根管时，稳定的细菌生物膜会释放出游离的细菌，从而 导致再次感染甚至在其他部位繁殖形成新的[7]。在牙体牙髓疾病致病菌 中，粪肠球菌（E.faecalis）的检出率在治疗前与治疗后有着明显差异, 特别是在根尖周疾病中，许多研究证明粪肠球菌是难治性根尖周炎的 优势菌[8, 9]。本课题小组的前期研究显示，对于暴露在空气中所形成的 1本课题由重庆市卫生局医学科研重点项目（2012-1-053）资助 2 感染根管，根管下段以下的预备对根尖生物膜的形成有促进作用。本 实验利用前期实验完成的体外模型形成粪肠球菌感染根管[10]，在不考 虑机体免疫机制的条件下，研究根管预备对粪肠球菌感染根管形成根 尖周炎的影响，为临床预防根尖生物膜的形成提供参考。 目的 感染根管内粪肠球菌的体外模型的建立，探讨根管预备对根尖细 菌渗漏的体外细菌生物膜的形成条件的影响。 材料和方法 1.离体牙拣选：正畸患者的健康前磨牙选择：二十。模型制作：将 离体牙各自密封于盛有 BHI 琼脂培养基的无菌小瓶内，使其根尖四毫 米浸没于培养基中。随机抽取 10 个作为实验组进行开髓，之后将粪肠 球菌接种于髓腔。于建模后 21d 将标本戊二醛固定后酒精梯度脱水， 石蜡包埋后，分别对牙颈部、根中 1/3 及根尖 1/3 进行组织切片，厚度 为 7μm。切片经 Brown and Brenn 染色法（改良革兰氏染色法）染色后， 置于光学显微镜下从低到高的倍数进行观察，记录观察结果并保存图 片。 2.离体牙选择：因正畸情况而拔除的健康双尖牙三百二十颗。模型 制作：将离体牙各自密封于盛有BHI琼脂培养基的无菌小瓶内，使其根 尖四毫米浸没于培养基中。建模后将其随机分为对照组A（n=70）、实 验组（n=250）。实验组做开髓处理后接种粪肠球菌，对照组不做任何 处理。全部置于三气培养箱中（含5%O2，85%N2，10%CO2；温度37℃）。 在做干扰前先将320个模型放置21d，并于1d及21d分别利用16SrRNA通 3 用引物PCR法检测根尖周细菌。确保体外模型未被细菌感染后随机将 实验组分为组B、C、D、E。B组为开髓组，C组为根管上2/3干扰组， D组为全长干扰组，E组为超长干扰组。5组分别于干扰后1d，7d，21d， 35d，49d，63d进行PCR检测（期间每两天用灭菌针管通过开髓孔滴入 新鲜灭菌BHI液态培养基）。根据结果利用SEM进行Ef根尖生物膜观察 并对根尖周细菌进行细菌培养。 结果 1.建立模型后二十一天利用16SrDNA通用引物PCR检测根管内及 根尖周细菌，对照组根管内及根尖周均未检测到细菌；实验组根管内 检测到粪肠球菌，并且组织切片Brown Brenn染色可见粪肠球菌感染 根管样本的牙本质小管中有深浅、长短不一的染色，证明牙本质小管 中有粪肠球菌定植。说明粪肠球菌感染根管的体外模型建模成功。 2.确定建模成功后，分别对5组于干扰1d，7d，21d，35d，49d，63d 进行粪肠球菌16SrRNA的PCR检测。其中A、B、C组始终未检测到粪 肠球菌；组D于7d检测到；组E于1d检测到。SEM下可以观察到D组及E