肥胖对大鼠生殖细胞线粒体凋亡途径的影响-泌尿外科专业论文.docxVIP

山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 II II 肥胖对大鼠生殖细胞线粒体凋亡途径的影响 背景： 中 文 摘 要 肥胖对人体健康的影响，尤其是营养性肥胖影响人体生殖系统的问题随着人们生活水 平的日益提高，越来越普遍，从而也成为了研究的热点。有研究表明，正常大鼠睾丸中存 在自发的生殖细胞凋亡现象，且具有其明显的规律性。凋亡发生时，线粒体在细胞凋亡的 过程中发挥重要的作用。线粒体膜通透性增加，膜电位降低，细胞内 NOS 生成增多，ATP 酶活性降低，膜间蛋白 Cytc 释放到胞浆中，激活 caspase-3 等凋亡相关因子，引起凋亡的 发生。 本文主要以免疫学、分子生物学以及生物化学的实验方法，考察营养性肥胖大鼠睾丸 生殖细胞凋亡发生的情况，以及 Cytc 和 caspase-3 的变化，初步探讨 Cytc 和 caspase-3 参 与生殖细胞凋亡调控的机制。 细胞凋亡早期，细胞内 ROS、NO 和 NOS 等活性氧类物质生成增加，导致细胞氧化损 伤增加。其中，Cyt c、AIF、caspase-3 等凋亡相关基因 mRNA，以及蛋白表达都显示出明 显规律性，并且与睾丸生殖细胞凋亡的规律相一致，这种现象为探讨线粒体参与营养性肥 胖大鼠睾丸生殖细胞凋亡的机制提供了必要的实验依据。 Cyt c 在线粒体调控细胞凋亡通路中处在中心地位，它通过激活下游 caspases 家族，继 而发生凋亡。caspases 家族是细胞凋亡通路的重要执行者。 在论文中，我们以 PCR 的方法检测大鼠睾丸中 Cyt c、caspase-3 基因 mRNA 表达的变 化；以免疫组织化学检测 Cyt c 和 caspase-3 蛋白的表达变化；采用 HE 染色以及 TUNEL 方法对睾丸的组织病理学和细胞凋亡进行观察。 目的： 通过建立营养性肥胖大鼠模型，探讨线粒体参与营养性肥胖大鼠睾丸生殖细胞凋亡的 机制。 方法: 健康雄性 Wistar 大鼠 40 只,按随机化原则分为两组,每组 20 只, 正常 wistar 大鼠为 对照组，对照组给予普通饲料喂养,高脂组用高脂、高热量饲料喂养建立营养性肥胖大鼠 模型，10 周末处死大鼠摘取睾丸。全自动生化分析仪(ACA)检测外周血总胆固醇（TC）、 甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；PCR 的方法检测大鼠睾丸中 Cyt c、caspase-3 基因 mRNA 表达的变化；以免疫组织化学检测 Cyt c 和 caspase-3 蛋白的表达变化；采用 HE 染色以及 TUNEL 方法对睾丸的组织病理学和细 胞凋亡进行观察。 结果： 1. 动物模型的建立： 对照组给予普通饲料喂养,高脂组给予高脂、高热量饲料喂养喂养。10 周后,高脂组较 III III 对照组大鼠体重增加均大于 20%,符合营养性肥胖大鼠模型。 高脂组 TC、TG、HDL-C 和 LDL-C(5.17±0.17、1.18±0.09、1.76±0.11、5.08± 0.18) 对照组（1.38±0.12、0.39±0.05、0.97±0.07、0.75±0.06） 与对照组比较，高脂组外周血 TC,TG,LDL-C 水平明显升高（p0.01）; 2. 大鼠睾丸组织病理观察： 正常情况下，大鼠睾丸精原细胞核大，常染色质呈颗粒状，线粒体形状完整；精母细 胞异染色质呈块状，线粒体形状完整；精子细胞核染色质致密而均匀，线粒体结构完整。 HE 染色发现，高脂组睾丸生精上皮破坏明显，各级生精细胞脱落，精子细胞和精母细胞 间隙变大，连接消失，精母细胞发生坏死。 3. 大鼠睾丸组织中凋亡细胞情况： 10 周末,对照组大鼠睾丸组织仅见散在分布凋亡的生精细胞,高脂组生精细胞凋亡指 数（37.17±2.74）较对照组（5.16±0.81）显著升高（P＜0.01），凋亡细胞以精原细胞和精 母细胞为主。 4. 大鼠睾丸组织中 Cyt c 和 caspase-3 蛋白表达情况： 免疫组织化学结果显示：caspase-3 蛋白表达阳性的精原细胞即明显增加，大鼠睾丸 Cyt c 蛋白表达阳性的精原细胞和精母细胞有增多趋势。 高脂组 Cyt c 蛋白（162.53±8.77）表达较对照组（134.37±6.96）明显升高（P＜0.01）； 高脂组 caspase-3 蛋白（155.83±6.62）表达较对照组（106.34±8.23）明显升高（P ＜0.01）。 5. 大鼠睾丸组织中 Cyt c mRNA、caspase-3 mRNA 表达情况： 高脂组 Cyt c mRNA（0.86±0.01）表达较对照组（0.49±0.02）明显升高（P＜0.01）； 高脂组 caspase-3 mRNA（0.95±0.04）