砀山酥梨石细胞发育过程中POD酶学特性及POD克隆-遗传学专业论文.docx

I I 摘要 砀山酥梨属白梨系品种，是我国栽培面积最大的梨品种之一，但近年来， 由于品种退化和管理粗放等原因，砀山酥梨出现了石细胞含量增多，口感多渣等 问题，严重影响了砀山酥梨的品质和经济价值。石细胞是由细胞壁次生加厚、木 质素沉积而形成的，因此，木质素的合成、转运和沉积与石细胞的发育有着密切 的关系。过氧化物酶(POD)是木质素合成过程中参与最后一步反应的关键酶，在 苯丙烷代谢形成香豆醇、松柏醇、芥子醇三种单体之后，单体在 POD 作用下脱 氢聚合形成木质素。目前，在植物体内参与木质素生物合成的 POD 的类型还不 清楚，该酶的底物尚未查明。因此，本试验以砀山酥梨为材料，对果实发育不同 时期，参与木质素合成的 POD 类型进行研究，以期阐明梨果实石细胞形成过程 中 POD 在木质素代谢途径中的作用，也为今后通过基因工程手段抑制梨果实木 质素合成及单体聚合，控制石细胞含量提供理论依据。 主要研究结果如下： 1.在砀山酥梨果实发育过程中，位于石细胞细胞壁及邻近区域的 POD 参与木质 素在石细胞细胞壁上的沉积； 2.花后 15～123 d，POD 同工酶谱带主要分为 3 组酶活性区，其中 PODⅠRf 值 为 0.13～0.23，PODⅡ为主要酶带，Rf 值为 0.44，PODⅢ的 Rf 值为 0.63～0.96； PPOD 是砀山酥梨果实发育过程木质素代谢关键酶 POD 的主要类型，参与木质 素的合成，促进石细胞的发育。 3.在砀山酥梨果实发育过程中，GSH-PX 在花后 27 d 出现高峰，酶活大小高达 611.76 U?g-1?min-1，PPOD 共有 3 个活性高峰期，分别出现在花后 31 d、43 d 和 55 d，其酶活变化分别为 184.5 U?g-1?min-1、221.4 U?g-1?min-1 和 242.9 U?g-1?min-1； 梨果实中 APX 在花后 47 d 达到高峰期，酶活性为 35.48 U?g-1?min-1；石细胞含 量高峰期出现在花后 51 d，为 17.82％；木质素含量高峰期分别出现在花后 47 d 和 63 d，分别为 6.47%和 7.00%。 4.砀山酥梨果实 PPOD 的最适 pH 为 6.5，最适温度为 35℃；最适底物浓度为 0.02 mol?L-1，Km 值为 4.4×10-2 m?mol?L-1。 5.采用 RT-PCR 和 3’RACE 克隆了砀山酥梨果实中 POD 基因的 cDNA 部分片段， I II 该大小为 833bp，含有 41bp 的 3’非编码区，792bp 的编码区，编码 264 个氨基 酸，与陆地棉等植物的 POD 基因的氨基酸序列具有 60%-81%的同源性；与陆地 棉中 POD 的亲缘关系最近，与菠菜中 POD 的亲缘关系最远。 关键词：砀山酥梨，木质素，GSH-PX，PPOD，APX PAGE PAGE III Study of POD Characterization and Cloning PODduring Stone Cell Development of Pyrus bretschneideri Abstract As one of Pyrus bretshneider Rehd, Pyrus bretschneideri cv. is one of the largest varieties of pears in our China. In recent years, due to the factors such as deterioration of variety and poor field management, stone cell content gets increased gradually, moreover, the texture becomes rougher with more pomace.The changes have adversely affected pear flavor and quality. Stone cells result from the formation of secondary cell wall thickening and lignin deposition. Therefore, the formation and development of stone cells is closely relevant to lignin biosynthesis, lignin transportation and lignin deposition. As a key enzyme, Peroxidase (POD) involves in the la