低能离子注入双酶产生菌Spj0104的诱变选育研究-林木遗传育种专业论文.docx

M M川川川AEE 州州州。。 刷刷刷AMV 唰唰唰哼 ， 川MMA咕 翩翩翩鱼 恻唰刷刷41 州州Y .中品休止科教式嗲 . 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所盟交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为 获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材 料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承姐， 作者签名:欲 知7 年 6 月 12 日 中高休止料载火嗲 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文 的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林 业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以来用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 本学位论文属于: 1、 保密口，在年解密后适用本授权书。 2、 不保密口4 (请您在以上相应方框打 .J ) 作者签名:岛采 导师签名:如廿俨 )aI{ 年阳立日 1叮叮月1i日 摘要 合成、半合成抗生素的研究，是探索和开发新抗生素的最重要的途径之一- ffjj D-对控基苯甘氨酸 (D pHPG) 是半合成。币内毗胶类抗生素的重要前体，是目 前制药行业党争激烈的产品之一，化学法制备 D-pHPG 带来严重的污染和毒害，而 酶法是较好的方法。酶法是利用 D-海因酶 (DHase) 将苯海因 (DL pHPH) 转化为 N- 氨甲酷基…D-对控基苯甘氨酸 (NC-D pHPG) ，N-氮甲酌基 -D-氨基酸毗胶水解酶 (DCase) 则继续将 NC-D-pHPG 转化为 D-pHPG。但现有的菌种产酶活力不商，故地育 高产菌株提高酶捕以及采用新技术提高酶利用率具有重要的研究价值。 首先对出发商株彻Ij0104 的酶活水平进行了验证，随之开展低能 W离子注入 技术的研究，对出发菌株运用单因子实验以确定最佳能量与剂量，采用正交法对 低能离子注入的参数进行了优化，并在最优条件下对于一次注入后诱变选育获得 的优良菌株 Spi03 和经过微波诱变扁的优良菌株 Sp902 进行了二次离子注入。最 后对于筛选到的高产菌株 Sp208 进行了发酵条件的优化和遗传稳定性检测。以下 是整个实验结果: (1)在显微镜下 Spj0104 呈妞杆状，生长周期比较长，在 0-21h 为生长延 滞期:从 21h 开始，。比。迅速增加，直到 57h，不再增大，且保持相对稳定的状态， 此为对数生长期; 57-69h OD 值相对稳定，处于稳定生长期。通过 HPLC 法测定经 DHase 和 DCase 催化眉生成的终产物。-pHPG 的含最，测定出该菌株的酶活为 0.118955 u/mL。 (2) 在低能离子投入的准备工作中先要对待诱变的菌液风干处理。在 30min 时，菌膜完全干燥，至 50min 时，商膜彻底干燥。随着时间的增加，菌株由于缺 乏水分利养料，致使存活率越来越低，所以当菌膜吹至 30min 时即可进行离子注 入处理。 (3) 对低能 W离子注入的能量和剂量分别在固定了脉冲和间隔时间，多次不 同剂量重复的前提下作了单因子实验，确定了最适合的能量为 30KeV 。在30KeV 能 量条件下，设计了多梯度的剂量，不问剂量下的存活率曲线为马鞍形曲线 在马鞍形曲线的马鞍附侧逃取了 6ωOXlω0 呵14飞io∞nsν/cm旷2 ，80X 1014 ions/cm2 ， 100X 1014ions/cm2 ，120X 1014ions/cm2 ，140X 1014ions/c旷达儿个剂量，试验结果 综合考虑酶活、存活率等几个参数，确定最佳剂量为 60 X 1014ions/cm2 在确定了 最佳能盘和剂量的基础上，采用了四因素二水平的正交实验，对能量、剂最、脉 忡和间隔时间进行正交优化设计。得出了最适诱变参数为 z 能量 20KeV ，剂量 40X 1014ions/cm2 ，脉冲时间158，间隔时间158。 (4)一次离子注入后筛选到一株优良菌株 Spi03，酶活达到了 0.2422 u/mL。 再将其在最佳离子注入条件下进行二次离子注入诱变，同时将经过微波诱变筛选 到的菌株 Sp902 号进行离子注入处理，分别筛选到了 Sp208 酶活为 0.3271u/mL和 Sp201 酶活为 0.2382u/酌，分别比原来提高了 35.53%和 28.41%， 经过微波和离子注入复合诱变的菌株在形态上变化很大，负突变株较多。从 众多的菌株中还筛选到…株菌株