低温脂肪酶产生菌株的筛选、发酵条件优化及其酶学性质研究-食品加工与安全专业论文.docx

万方数据 万方数据 石河 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作 了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学 位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论 文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数 据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 摘 要 目的：低温脂肪酶因具有低温高催化活性，对热敏感以及耐有机溶剂等特性，在食品、洗涤、 脂类加工、制药以及低温环境修复等方面有着广泛的应用前景。目前低温脂肪酶大多来自于 低温微生物，而自然界中分布着极其丰富的各类极端环境，在这些极端环境中蕴藏着类型多 样的极端环境微生物资源。低温微生物会为了适应低温环境而合成、分泌大量的低温酶类。 本文旨在从天山冰川冻土层中分离产低温脂肪酶菌株，并挑选一株高产菌株，进行初步鉴定 及其产低温脂肪酶的条件探讨。为挖掘不同环境下低温脂肪酶产生菌，获得具有新特性的高 酶活力的脂肪酶奠定更坚实的基础。 方法：本实验依托新疆独特的地理环境，利用 Rhodamine-B、Tween-80 不同的培养基对采自 新疆天山一号冰川冻土层中的菌株进行分离、纯化，结合棕榈酸对硝基苯酯（p-NPP）比色 法，筛选出产低温脂肪酶酶活较高的菌株，挑选一株研究其生长特性及常规生理生化特性， 并结合 16S rDNA 基因序列初步确定其所属菌属。再利用响应面法对菌株产酶条件进行优化， 最后对所产低温脂肪酶进行初步纯化及其酶学性质研究。 结论： 1、本实验利用 Rhodamine-B、Tween-80 不同的培养基从新疆天山一号冰川冻土中， 分离筛选得到产脂肪酶的菌株有 75 株，经过进一步的复筛，获取一株产脂肪酶酶活力较高的 菌株，经过形态学观察、生理生化实验以及 16S rDNA 序列同源性分析，该菌株为假单胞菌 属，命名为 Pseudomonas sp.T1-39。 2、通过菌株最适生长温度等实验，其最适生长范围为 16℃~30℃，属于耐冷菌范畴。在 摇瓶发酵的基础上，对 Pseudomonas sp.T1-39 产酶条件进行了优化。进行单因素实验，探究 碳源、氮源、金属离子、诱导剂以及温度、初始 pH、发酵时间等不同因素对产酶的影响，确 定最佳产酶培养基的单因素水平：可溶性淀粉 5.0g/L，胰蛋白胨：硫酸铵（1:1）10.0g/L，橄 榄油乳化液 40mL/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，K2HPO42.0g/L。培养温度 16℃，培养基初始 pH 值 9.0，接种量 2%，装样量 20mL/250mL，发酵培养 32h 达到产酶高峰，另摇床转速在 180rpm。 3、单因素结果的基础上，利用 Plackett-Burman 设计筛选出对发酵酶活影响最大的三个 因素：温度、胰蛋白胨和初始 pH。再通过最陡爬坡实验确定最大产酶区域，并以该区域为中 心点进行 Box-Benhnken 响应面设计。确定出实际值，温度 17℃，初始 pH 为 8.5，胰蛋白胨 4.6g/L，优化后脂肪酶的酶活达 10.71U/mL。是优化前的 3.42 倍。 4、对 Pseudomonas sp.T1-39 所产脂肪酶进行硫酸铵沉淀，并对初步纯化后的脂肪酶进行 酶学性质研究。结果表明：Lip-39 的最适反应温度为 30℃，在 20℃处理 1h 后，酶活仍保持 70%左右，60 ℃处理 30 min 酶活不到 40%，对热敏感，属于低温脂肪酶脂肪酶范畴。最适 pH 为 9.0，pH 在 7.0~9.0 范围内酶活相对比较稳定。金属离子 Mg2+、Zn2+、Ni2+、Ba2+对该 酶有明显的激活作用，10mmol/L 的金属离子螯合剂对 Lip-39 酶有着强烈的激活作用。有机 溶剂正己烷对酶的活力有显著的激活作用。 关键词：假单胞菌，低温脂肪酶，酶活，发酵 I Abstract Object:Cold-adapted lipase is one of the most important enzyme for industry application with properties of high catalytic activity at low-temperature、sensitiv