肝癌细胞与肝星状细胞相互作用的实验研究-病理学专业论文.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 1 PAGE 1 肝癌细胞与肝星状细胞相互作用的实验研究 中文摘要 研究目的 观察肝癌细胞与肝星状细胞相互作用对二者生长状态的影响，初步探讨肝癌 细胞和间质细胞的相互作用在肝癌发展过程中的作用，以期进一步了解肝癌细胞 的生物学行为，进而为肝癌治疗提供新思路。 方法 以人肝癌 HepG2 细胞系和肝星状细胞 HSC-T6 细胞系为研究对象，实验分为 三个部分：1、观察 HepG2 细胞条件培养基对 HSC 增殖活化的影响；2、观察活化 HSC 条件培养基对 HepG2 细胞增殖的影响；3、观察直接共培养的 HepG2 细胞和 HSC 超微结构改变。 1、HepG2 细胞和 HSC-T6 细胞的体外培养及传代 采用含青霉素 100U/ml、链霉素 100U/ml，10％胎牛血清的 DMEM 培养液， 37℃、5％CO2 及饱和湿度下培养，隔天更换培养液，待细胞生长至 80％～90％密 度时，0.25％胰蛋白酶消化，按 1∶3 的比例传代。 2、HepG2 和 HSC 条件培养基的制备 HepG2/HSC 以 3×104/ml 的密度接种于含 10％胎牛血清的 DMEM 高糖培养基 中（各 3 瓶），分别收集 12h、24h、48h 的培养上清，经 0.22μm 的微孔滤膜过滤， 即获得 HepG2/HSC 的 12h、24h、48h 条件培养基储存液，–20℃保存备用。 3、观察 HepG2 细胞条件培养基对 HSC 增殖活化的影响 1）实验分为以下几组： ①对照组：普通单独培养的 HSC 细胞 ②实验组 1：HSC 细胞加入 12h 不同浓度（1∶8、1∶4、1∶2）的 HepG2 条件培养基 ③实验组 2：HSC 细胞加入 24h 不同浓度（1∶8、1∶4、1∶2）的 HepG2 条件培养基 ④实验组 3：HSC 细胞加入 48h 不同浓度（1∶8、1∶4、1∶2）的 HepG2 条件培养基 2）MTT 法检测不同时间点及不同浓度的 HepG2 条件培养基对 HSC 增殖的影 响 3）流式细胞仪检测不同浓度 48h 的 HepG2 条件培养基对 HSC 细胞周期的影 响 4）免疫组化法检测不同浓度 48h 的 HepG2 条件培养基对 HSC α-SMA 表达的 影响 4、观察 HSC 条件培养基对 HepG2 细胞增殖的影响 1）实验分为以下几组： ①对照组：普通单独培养的 HepG2 细胞 ②实验组 1：HepG2 细胞加入 12h 不同浓度（1∶8、1∶4、1∶2）的 HSC 条件培养基 ③实验组 2：HepG2 细胞加入 24h 不同浓度（1∶8、1∶4、1∶2）的 HSC 条件培养基 ④实验组 3：HepG2 细胞加入 48h 不同浓度（1∶8、1∶4、1∶2）的 HSC 条件培养基 2）MTT 法检测不同时间点及不同浓度的 HSC 条件培养基对 HepG2 细胞增殖 的影响 3）流式细胞仪检测不同浓度 24h 的 HSC 条件培养基对 HepG2 细胞周期的影 响 4）免疫组化法检测不同浓度 24h 的 HSC 条件培养基对 HepG2 细胞 PCNA、 PPARγ 表达的影响 5、电镜观察直接共培养 HepG2 和 HSC 的细胞超微结构改变 结果 1、HepG2 细胞条件培养基对 HSC 增殖活化影响 1）MTT 结果显示：不同浓度 12h、24h、48h 的 HepG2 条件培养基对 HSC 均 有促增殖作用，各浓度实验组与对照组相比，细胞数均有显著增加（P0.05）。12h、 48h 的增殖曲线显示作用强度与条件培养基浓度关联，呈上升变化。24 小时的 HSC 增殖曲线随条件培养基浓度的升高有所下降，但细胞增殖仍明显高于对照组。 2）FCM 检测细胞周期结果显示：经不同浓度 48h 的 HepG2 条件培养基处理 后，HSC 的 G0/G1 期细胞比例下降，S 期细胞比例上升，与对照组相比有显著性差 异（P0.05）。实验组与对照组相比，增殖指数 PI｛（S＋G2/M）（/ 升高。 G0/G1+S+ G2/M）｝ 3）α-SMA 免疫组化结果显示：经不同浓度 48h 的 HepG2 条件培养基作用后， HSC 的 α-SMA 表达增强，且与条件培养基浓度相关。各实验组与对照组相比有明 显差异（P0.01）。 2、HSC 条件培养基对 HepG2 细胞增殖的影响 1）MTT 结果显示：不同浓度、不同时间 HSC 条件培养基对 HepG2 细胞均有 促增殖作用。各时间点、各浓度实验组与对照组相 比，细胞数均有显著增加 （P0.05），增殖曲线显示作用强度与条件培养基时间和浓度关联，均呈上升变化。 2）FCM 检测细胞