肝癌细胞中ALR基因靶向沉默后全基因组表达谱的变化-内科学传染病学专业论文.docxVIP

重庆 重庆医科大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名对照表 英文缩写 ALR 英文全称 Augmenter of liver regeneration 中文全称 肝再生增强因子 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 FAD Flavin adenine dinucleotide 黄素腺嘌呤二核苷酸 FBS Fetal bovin serum 胎牛血清 HBV Viral hepatitis type B 乙型病毒性肝炎 HCV Hepatitis C virus 丙型肝炎病毒 HCC Hepatocellular carcinoma 肝细胞肝癌 HIV Human immunodeficiency virus 人类免疫缺陷病毒 mRNA Message ribonucleic acid 信使核糖核酸 min Minute 分钟 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s Second 秒 siRNA Small interference RNA 小分子干扰 RNA RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 RNAi RNA interference RNA 干扰 1 肝癌细胞中 ALR 基因靶向沉默后全基因组 表达谱的变化1 摘要 目的： 筛选并构建针对肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration， ALR）基因的 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒表达载体， 并感染肝癌细胞株 HepG2、QGY 以及永生化的正常肝细胞 L02 验证 干扰效果，选取 HepG2 细胞进行基因芯片检测，分析 ALR 基因沉默 后全基因组表达谱的变化，为进一步研究 ALR 在肝癌的发生、发展过 程中具体作用机制奠定基础。 方法： 1.ALR 基因最佳干扰慢病毒载体的筛选、构建及验证：针对 ALR 基因序列设计并合成 4 个 siRNA 靶点，合成靶序列的 Oligo DNA，退 火形成双链 DNA，与经 HpaI 和 XhoI 双酶切线性化的 GV118-GFP 载 体连接产生重组慢病毒载体，转化感受态细胞，PCR 筛选阳性克隆， 测序鉴定。在包含 ALR 基因的质粒中以 PCR 法扩增出 ALR 基因，克 隆至慢病毒载体 GV143，构建 ALR 基因的过表达载体质粒，然后将 RNAi 重组慢病毒载体和 ALR 的基因表达质粒共转染 293T 细胞，以 本课题受重庆市卫生局医学科研计划项目（2010-2-130，2012-1-042）资助。 2 Western blot 方法检测其对目的基因 ALR 的敲减效果。将筛选出的最 佳 RNA 干扰慢病毒载体与 pHelper1.0 和 pHelper2.0 两种辅助包装载 体质粒共转染 293T 细胞进行病毒包装，收集细胞上清液，浓缩获得 高浓度的慢病毒浓缩液后，用逐孔稀释法测定病毒滴度。将包装浓缩 后的重组慢病毒转染肝癌细胞株 HepG2、QGY 及永生化的正常肝细 胞 L02，使用倒置荧光显微镜来观察其转染的效率，Real-time PCR 和 Western blot 法检测干扰质粒对 ALR 在基因及蛋白水平上的敲减效果。 2.基因芯片分析：以分别转染 RNAi 重组慢病毒和阴性对照病毒 的 HepG2 细胞为干扰组和对照组，提取细胞总 RNA，质检合格后先 逆转录为 cDNA，再将其转录为带生物素标记的 cRNA，经纯化后与 芯片进行杂交，洗涤后用 AGCC 软件进行扫描分析以获取数据。以 Fold Change≥1.5 或 ≤0.7 作 为 标 准 来 筛 选 差 异 表 达 基 因 ， 并 采 用 Real-time PCR 法来验证芯片的结果。然后对筛选出的差异表达基因进 行 GO 分析和 Pathway 分析，以 P0.05 表示有统计学意义，且 P 值越 小，说明显著性越强。 结果： 1.经测序鉴定证实成功构建了 ALR RNAi 慢病毒载体及 ALR 基因 过表达载体。两次 Western blot 实验结果显示，相较于阴性对照组， KD1 组 ALR 蛋白的表达水平（0.51±0.02，0.36±0.09 ）、KD2 组 ALR 蛋白的表达水平（0.65±0.04，0.49±0.02），KD3 组 ALR 蛋白的表达水 平（0.62±0.07，0.52±0.02）均有所降低（P 均0.05），而以