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肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织 HBVcccDNA的原位检测-病理学与病理生理学专业论文
独 创 声 明
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目 录
肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织 HBVcccDNA 的原位检测……………………1 中文摘要 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
A B S T R A C T … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 英汉缩略词对照表……………………………………………………………5 前言 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 6
1 材 料 与 方 法 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 9
2 结果 … … ……… … …… …… … …… … …… …… … …… … ………1 6
3 讨论 ………………………………………………………………… 2 3
4 结论 ………………………………………………………………… 27
参 考 文 献 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 28
综述…………………………………………………………………………… 33
攻读学位期间发表的学术论文目录………………………………………… 59
致谢…………………………………………………………………………… 60
PAGE
PAGE 1
肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织
HBVcccDNA 的原位检测
中 文 摘 要
目的:原发性肝细胞癌(HCC)是一种常见的高度恶性肿瘤,其发病率位 居我国癌症发病率的第二位。流行病学证实乙肝病毒(HBV)的感染是HCC 发生的独立危险因素。共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV生命周期中重 要的复制中间体,是乙型肝炎病毒前基因组RNA( pgRNA )的原始合成模 板,已经被公认为HBV持续感染和肝脏进行性病理改变的根本原因。体外 试验及动物试验研究均提示HBVcccDNA与肝细胞癌变的发生密切相关。目 前,肝组织内HBVcccDNA的定量检测方法随着PCR技术的发展和应用已日 趋成熟,而人肝癌组织内HBVcccDNA的定位检测研究,国内外鲜见报道。 本研究通过一种新型的原位检测方法,检测HCC患者癌及癌旁组织中 HBVcccDNA的表达,探讨其在HCC中的意义,为临床上原发性肝细胞癌的 预防和治疗提供新的理论根据。方法:收集20例北京302医院2011年9月-2012 年9月期间住院的HCC患者癌及癌旁组织手术切除标本,经10%中性福尔马 林固定,石蜡包埋,5μm连续切片后使用。采用不降解质粒的ATP 依赖的 DNA ( PSAD)酶消除松弛的环状HBVDNA(rcDNA)后,根据我国常见的 HBV基因型B、C 基因组全序列, 设计引物4对,应用原位滚环扩增(RCA) 的方法只扩增环状的DNA,再采用针对HBVcccDNA与HBVrcDNA结构上的 差异所设计的5端地高辛标记的特异性引物进行直接原位跨缺口PCR,进一 步扩增HBVcccDNA。通过免疫组织化学方法进行显色,在显微镜下观察 HBVcccDNA在肝组织中表达及分布。以肝癌患者肝组织为例,设置无引物、 无地高辛标记引物、无Phi29酶和DNA 聚合酶反应体系,以及非乙型肝炎 病毒感染肝组织(包括健康成人肝组织5例,转基因小鼠肝组织2例,丙型
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