蛋白磷酸酶2A调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究-胸心血管外科学专业论文.docxVIP

蛋白磷酸酶 2A 蛋白磷酸酶 2A 调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究 中文摘要 蛋白磷酸酶 2A 调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究 中文摘要 背景：缺血性心脏病（IHD）是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求 之间不平衡而导致的心肌损害，其病理改变是缺血区心肌细胞因缺血缺氧而坏死，梗 死区逐渐被纤维疤痕所替代，残余心肌则代偿性肥厚，发生心室重构，而心室重构正 是造成心梗患者顽固性心力衰竭和死亡的主要原因，虽然药物及介入等治疗手段发展 日新月异，但目前仍无法从根本上逆转心室重构及后续的心力衰竭。骨髓间充质干细 胞（BMSCs）可促使心肌细胞分裂及再生，修复病变的心肌组织，并维持心脏的自 稳态，改善心脏功能，BMSCs 移植已作为治疗心衰的一种手段。近年来大量研究发 现：BMSCs 在心肌组织修复过程中存在迁移。反应性 BMSCs 是如何迁移到病变心肌 组织的，目前已有大量研究表明趋化因子及蛋白磷酸激酶参与 BMSCs 的迁移，而蛋 白磷酸酶对 BMSCs 的迁移作用方面的研究报道尚少。 目的：研究蛋白磷酸酶 2A（PP2A）对本底水平及 SDF-1/CXCR4 轴介导的骨髓 间充质干细胞（BMSCs）迁移的调控；探寻 SDF-1/CXCR4 轴介导的 BMSCs 迁移过 程中可能发挥作用的 PP2A 功能性调节亚基。 方法：本实验以体外培养的 SD 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）为研究模型， 采用 PP2A 的特异性抑制剂，并结合脂质体转染技术导入 siRNA，从不同的角度调节 PP2A 的活性，并采用划痕实验和 Transwell 迁移小室实验评价 PP2A 对 BMSCs 迁移 的调控作用。（1）划痕实验（wound-healing）：分别用 12 孔板培养不同处理的各组 细胞，每孔接种细胞数控制为 1.0×105/ml，进行划痕实验，在显微镜下观察划痕修复 的过程，比较不同处理组细胞水平运动能力的差异。（2）Transwell 小室体外迁移实 验：取生长状态良好的 BMSCs 细胞培养 48h 后，消化并收获细胞，用无血清 DMEM 低糖培养基洗 3 次，分别接种 2.0×105 个细胞于已行各组处理因素浸润的 Transwell 小室中（滤膜微孔直径 8μm），行迁移实验。迁移 4h 后剪下滤膜，用 DAPI 荧光染 液染色，在 20 倍荧光显微镜下，每孔计数 5 个视野的细胞数，并取平均值，比较不 I PAGE PAGE IV PAGE III PAGE III 中文摘要 蛋白磷酸酶 2A 调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究 同处理因素下 BMSCs 垂直运动能力的差异。取生长状态良好的 BMSCs 分别进行脂 质体转染 siNC 和 siPPP2Ca，前者为对照组，后者沉默 PP2A 催化亚基 PPP2Ca，采用 Transwell 小室迁移实验，通过与对照组的比较，评价沉默 PPP2Ca 后 BMSCs 迁移能 力的变化。通过实时定量 PCR 检测 SDF-1 刺激后 PP2A 主要调节亚基的表达变化， 探寻 SDF-1 介导 BMSCs 迁移过程中可能起作用的功能性调节亚基。 结果：（1）Transwell 小室迁移实验中，10nM、25nM、50nM 三个 OA 梯度浓度 组迁移细胞数均减少，较对照组有统计学差异（p0.05）；BMSCs 迁移能力与 OA 浓度呈负相关，OA 10nM 组与 OA 25nM 组迁移到滤膜上的细胞数的差异无统计学意 义（p0.05），OA 50nM 组与 OA 10nM 组和 OA 25nM 组均有差异（p0.05）。SDF-1 与 OA 共刺激组 BMSCs 的迁移能力较单 SDF-1 刺激组明显降低（p0.05）（2）划 痕实验中，本底水平 BMSCs 迁移的距离比较，OA 作用下 BMSCs 的划痕愈合距离明 显小于对照组，12h 时间点 OA 组与对照组无统计学差异（p0.05），24h、48h 时间 点较对照组均有差异（p0.05）。验证 SDF-1/CXCR4 轴的趋化作用，引入 SDF-1 作 为迁移的化学诱导物后，SDF-1 和 OA 共刺激组在 12h、24h、48h 的划痕愈合距离较 SDF-1 组均明显减少，有统计学差异（p0.05）。（3）siPPP2Ca 转染后，PPP2Ca 表达降为对照组的 8.88 ± 1.52%（p0.05）。转染 si-PPP2Ca 的 BMSCs 迁移能力较对 照组明显减弱（p0.05）；引入 SDF-1 刺激后，转染 siPPP2Ca 的 BMSCs 的迁移能 力与对照组相比，迁移能力有明显减弱（p0.05）。（4）骨髓间充质干细胞经 SDF-1 刺