浙江大学生物化学丙实验报告.docVIP

次鎗实 次鎗实验报告 专业：农业资源勹环境 姓名：李佳怡 学号： 3130100246 日期：2015.5.19 地点：生物实验屮心310 鲍其琛 鲍其琛 课程名称：生物化学实验（丙） 实验名称：离子交换柱层析分离纯化蔗1 一、实验目的和要求（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 七、实验结果与分析（必填） 指导老师：方祥年 成绩： 同组学生姓名：金宇尊、 二、实验内容和原理（必填） 叫、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 丨、学习离子交换层析的基本原理； 2、 学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术; 3、 学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 订二、实验内容和原理 （1）实验原理 1、离子交换层析： 以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离 子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一 pH值的溶液屮，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交挽剂的亲和 力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提商时，使某一种蛋白质的电荷被屮和，与离 子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱丁来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖）可逆交％工六 基质 电荷基团 反离子 （交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖） 可逆交％ 工六 阴离 子交 换剂 电荷基团 反离子 溶液中的离子 等电点蛋白质净电 等电点 蛋 白 质 净 电 荷 吸附明离子交換剂 pH 1 2 3 4 5 6 吸附阳离子交換剂 7 8 9 10 pH pj +) pH = |jj (0) pH pj (-) 由于蔗糖酶的pi偏酸性，所以在pH7.3缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷， 因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的FI的。 2、酶活力检测（定性检测） 蔗糖酶（（3-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26）,能催化非还原性双糖（蔗糖） 裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验采用3.5—二硝基水杨酸法，其原理是3.5 —二硝基水杨酸与还原糖共热（1OO°C） 被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由 此來确定并收集蔗糖酶纯化样品。 （2）实验内容 1、 离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品III; 2、 定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。 三、实验材料与试剂 1、 实验材料 蔗糖酶籼分离纯化样品III 2、 实验试剂 DEAE-Sepharose Fast Flow （弱碱性明离子交换剂）; 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液； 20mmol/L Tris-HCl, （lmol/L NaCl） pH7.3 缓冲液； 0.2mol/L乙酸缓冲液,pH4.5 ； 5%蔗糖溶液； 3, 5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）。 附：3, 5-二硝基水杨酸试剂配罝方法 甲液：溶解6.9g结品酚于15.2ml 10%NaOH溶液屮，并用水稀释至69ml,在此溶液屮加6.9g亚硫酸氢 钠；乙液：称取255克酒石酸钟钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸 溶液。甲，乙二溶液相混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7-10天以后使川。 U!实验器材与仪器 U! 实验器材与仪器 1、 1、 高速冷冻离心机； 2、 层析柱（（1）1.0X20 cm ）； 3、 恒流泉（流速 0. 8?lml/min） （lOrpm）； 4、 梯度混合器（100ml梯度杯）； 5、 核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）; 6、 记录仪（纸速:0. 5mm/min；灵敏度：50mV）； 7、 部分收集器及收集试管（4nd/管）； 8、 铁架台、夹子（固定层析柱用）； 9、 一20°C冰箱（保存样品用）； 10、 微呈移液枪 200ul、lOOOul； 11、 1.5ml离心管（留样品III和样品IV用）； 12、 7mr离心管（留样品IV用）； 13、 恒温水浴（100°C）: 14、 试管、移液管、试管架等。 五、操作方法和实验步骤 1、 样品处理（实验1已经完成） 取其屮体积较多一只离心管屮保存溶液用作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶; 剩余一只用于蔗糖酶蛋白含:W:测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS分析。 本实验中取离心管中较多的一只离心管用于实验。 2、 装柱、平衡： 检漏：在层析柱中装入水，观察其有无渗漏，如有渗漏，需进