细胞计数与观察.pptVIP

细胞培养（四） 暨 南 大 学 医 学 院 生物化学教研室 费 嘉 细胞培养的应用价值 细胞培养是生命科学研究中常用的、基本的技术 体外细胞培养使长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动的动态过程，故可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作； 该方法能排除神经体液因素的影响及肝肾解毒功能的干扰，观察某些因素和药物对培养细胞的直接作用。 节约经费 可生产生物制品、单克隆抗体和基因工程制品等多种产品 细胞培养方法的缺点 培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。 培养方法、试剂对细胞形态和功能有一定影响。 长期体外培养细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 细胞计数 细胞生长状况的观察 ----- 细胞数目测定技术 原理：计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为 0.1mm3。根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量，以细胞数/毫升表示 。 实验程序： １．制备样品 取悬浮细胞或细胞悬液，稀释到一定比例。２．检查记数板 （1） 擦洗 （2） 冲洗 （3） 镜检 ３． 加样 先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2~3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。 ４． 计数 （1） 找计数室 在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格网位置。（2） 转高倍镜 使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。（3）计数 计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算在内。 （4） 清洗 细胞数计算公式： 细胞数/毫升培养液 = 注意事项： 1、??? 加液时勿使液体漫过盖玻片或出现气泡。 2、??? 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。 3、??? 如细胞团占10%以上，说明消化不充分，或细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液，再重新计数。 培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种并培养一段时间，直到下次传代。这已成为培养工作中的一种习惯说法。 如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。 细胞一代与细胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同，在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。 细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 1．潜伏期 2．指数增生期 3．停滞期 1．潜伏期（Latent Phase） 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。 接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁期，悬浮期结束。 细胞贴壁后，还需要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期，这一阶段称为细胞潜伏期。 细胞处在潜伏期时，可有运动活动，但基本无增殖，分裂相鲜见。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。 细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。 初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时。 细胞接种密度大时潜伏期短。 这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。 指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。 一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。 一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。 pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。 指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。 在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。 细胞接触抑制（Contact Inhibition） 细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。 恶性细胞无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。 细胞密度抑制（Density Inhibition） 肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能