课件：总RNA的提取和RT-PCR.pptVIP

RT-PCR-逆转录-聚合酶链反应 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 反转录酶的选择 随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 引物的选择 PCR 反应系统的组成 模板 引物 dNTP 耐热的 DNA聚合酶（Taq酶） 缓冲液 （一）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 (二)引物 引物的设计：使用引物设计软件NTI 9.0,PRIME 5.0等 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为18～21个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 (G+C）%含量:引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 引物的合成：找专门的生物公司进行引物合成 引物的特异性： 引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用 引物的浓度： 引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性 引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成 一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 ～ 1μmol/l 为宜 （三）Taq 酶 从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的热稳定性 DNA 聚合酶 酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增 每 100μl 反应液中含 1-2.5u Taq DNA 聚合酶为佳 保存：-20 ℃，避免反复冻存 本实验所扩增的产物DNA片段长度300bp～400bp, 可取5μlPCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA-marker评估扩增的特异性。 琼脂糖凝胶电泳 实验材料 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 染料：Gelview、EB 电泳缓冲液：TBE 琼脂糖 DNA Marker 5000 溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性. Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光. 常用染料 实验材料 含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。 DNA Marker 实验材料 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳