高保真酶介导的突变敏感性分子开关用于三种常见遗传性疾病分子诊断的研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 高保真酶介导的突变敏感性分子开关用于三种常见遗传性疾病 分子诊断的研究 中文摘要 第一部分 突变敏感性分子开关快速检测 mtDNA 热点突变 及其在预防 AAID 中的应用 目的 利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关，建立在同一 PCR 反应体系中对 mtDNA 12S rRNA 基因 A1555G 和 C1494T 热点突变可以同时进行快速筛查的技术平 台，指导 AmAn 的合理用药，从根本上全面预防 AAID 的发生。 方法 mtDNA 12S rRNA 基因 PCR 产物克隆至 pMD19-T 载体，转化 E.coli JM109 感 受态细胞，通过 LB/Amp/IPTG/ X-gal 平板筛选白色克隆，载体通用引物对其进行菌 液 PCR 扩增初步确定阳性克隆，并通过序列分析进行确证，得到 mtDNA 12S rRNA 基因的野生模板质粒。反向 PCR 对其野生质粒模板实施体外 mtDNA 12S rRNA 基因 A1555G 和 C1494T 定点突变，Dpn I 内切酶降解甲基化的野生质粒 DNA 模板后，再 次转化 E.coli JM109 感受态细胞，同前筛选阳性克隆，测序鉴定得到 mtDNA 12S rRNA 基因 C1494T 和 A1555G 突变质粒模板。进一步设计与 mtDNA 12S rRNA 基因 A1555G 和 C1494T 突变位点配对及三末端不配对的 3’硫化修饰正向引物，在其下 游设计一条公共反向引物，分别构成野生检测引物与突变检测引物，对 mtDNA 12S rRNA 基因野生质粒模板和 A1555G 和 C1494T 突变质粒模板，进行高保真 DNA 聚 合酶介导的双向引物延伸反应，利用凝胶成像系统对其 PCR 结果进行分析。并将其 优化的 PCR 体系用于临床健康志愿者 mtDNA 12S rRNA 基因 C1494T 和 A1555G 突 变的筛查。 结果 当突变检测引物与突变模板 mtM 配对时，引物被延伸，有 PCR 产物；与野生 模板 mt 不配对时，引物却不能被延伸，无 PCR 产物。同样，野生检测引物只有与野 4 生模板 mt 匹配时得以延伸，而与突变模板 mtM 不匹配时则不能延伸。突变敏感性分 子开关对 40 例临床健康志愿者 mtDNA 12S rRNA 基因 C1494T 和 A1555G 突变的筛 查未发现 C1494T 和 A1555G 突变携带者。 结论 高保真 DNA 聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够快速筛 查 mtDNA 12S rRNA 基因 A1555G 和 C1494T 突变 ，达到非此即彼的二元化效果， 该分子开关在 AAID 基因筛查中具有较大的潜在应用价值。 关键词 氨基糖苷类抗生素；线粒体 DNA；AAID；高保真酶；硫化修饰 第二部分 突变敏感性分子开关快速筛查 NSHL 热点突变技术的建立 目的 利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关，建立在同一 PCR 反应体系中对 NSHL 患者 GJB2 基因 235de1C、299-300delAT、176del16bp、35de1G 突变，SLC26A4 基因 IVS7-2AG、H723R 突变，mtDNA 12S rRNA 基因 A1555G、C1494T 突变 8 个 热点突变可以同时进行快速筛查的技术平台，达到指导个体化用药及为优生优育咨询 提供保障的目的，造福耳聋患者。 方法 GJB2 基因 PCR 产物与 SLC26A4 基因重叠 PCR 拼接的 DNA 片段分别克隆至 pMD19-T 载体，转化 E.coli JM109 感受态细胞，通过 LB/Amp/IPTG/ X-gal 平板筛选 白色克隆，载体通用引物对其进行菌液 PCR 扩增初步确定阳性克隆，并通过序列分 析进行确证，得到 GJB2 基因与 SLC26A4 基因的野生模板质粒。GJB2 基因 4 条反向 定点突变引物 5’末端磷酸化后，与原始野生质粒模板 GJB2 进行退火、延伸、连接 反应形成新的突变单链，再通过引物双向延伸反应获得突变双链 DNA 片段，突变双 链 DNA 片段经 EcoR I、Hind III 双酶切、凝胶回收后克隆于目的载体中，转化 E.coli JM109 感受态细胞，LB/Amp/IPTG/ X-gal 平板筛选，随机挑选白色克隆用载体通用 引物进行菌液 PCR 扩增和双酶切的初步鉴定后进行 DNA 测序，获得同时包含 GJB2 基因 235de1C、299-300del AT、176del16bp、35de1G 突变的突变质粒模板。先后通过 反向 PCR 定点突变与重叠延伸产生特异性位点诱变方法对 SLC26A4 基因的野生模板 质粒实施体外 IV