高产γ氨基丁酸红曲菌种培育及深层发酵关键技术研究-植物学专业论文.docxVIP

Breeding Breeding of Higher T-Aminobutyric Acid-Producing Monascus and Optimization Study on the Submerged Fermentation Candidate：Yan Ye Supervisor：Prof．Donghua Jiang Discipline：Botany College of Chemistry and Life Science Zhejiang Normal University,Jinhua 321004，Zhejiang ： - j ，0●l ，0●l ，__一 k k lI 本论文得到 浙江省重大科技专项(2007C12036) 浙江省自然科学基金项目(Y3090343) rn- -l。he researcn Was supportea Dy tlle inalor SClence and technology plan of Zhejiang province(2007C12036)and the Natural Science Foundation of Zhej iang Province 、 (Grant Y3090343) t ，，，●I ，，，●I 高产Y．氨基丁酸红曲菌种培育及深层发酵关键技术研究摘要 高产Y．氨基丁酸红曲菌种培育及深层发酵关键技术研究 摘要 Y．氨基丁酸(GABA)是一种广泛分布于动植物、微生物体内，天然存在的非蛋白质氨 基酸。在动物体内，GABA主要作为一种抑制性神经递质存在，参与脑循环生理活动， 具有降低血压、促进生长、治疗癫病、抗衰老、促进采食行为、预防肥胖、促进生殖、 肝功能活化等多种功能，在食品和药品工业中被广泛使用。 本文从自然环境中分离到一株红曲菌27号，通过诱变、培养基组分优化、发酵条 件优化提高Q也A产量，基于小试优化数据完成产业化中试。 首先，从红曲米、红腐乳、酒曲、．豆瓣酱中分离红曲菌300株，通过改良纸层析法 进行初筛，其中一株27号菌株的GABA产量为2．32 g／L。通过形态学手段鉴定其为红 色红曲菌(Monascus rub们，并确定其为今后诱变实验的出发菌株。通过紫外诱变、亚硝 酸诱变、氯化钴诱变和亚硝酸．紫外诱变获得一株GABA产量高达3．12 g／L的诱变菌株(菌 株编号为27．A015)，通过连续传代实验(连续20次传代)，未出现回复突变，即该菌株具 有稳定的遗传性，且生长速度较快，因此采用该株红曲菌株作为后续实验的出发菌株， 并命名为红曲菌X27。 其次，使用Plackett-Burman法(P．B法)确定对红曲菌液体发酵生产GABA有重要影 响的三个因素分别是温度，pH和通气量。通过爬坡实验确定RSM实验的中心点。利用 响应面法实验获得的回归系数， 建立回归方程： Y--209．366+3．435X1+55．945X2+0．103X3·0．059Xi二-5．135X2z-O．0002X3z-O．081XiX2—0．001Xl X3．0．019X2xs，通过计算获得最优发酵条件为：34℃，pH 5．5，通气量120 L／h，一级种 子，罐压0．3 MPa，接种量5％，搅拌桨转速200 r／min。优化后的GABA产量达到9．18 g／L， 比未优化提高74．7％。对红曲菌X27进行碳源、氮源、谷氨酸钠的分批补料研究发现， 谷氨酸钠对红曲菌X27的生长有一定的抑制作用，发酵初期的低浓度谷氨酸钠是使得菌 体大量生长的关键，缩短延滞期和发酵周期，使得生产成本得到有效的控制。通过对氮 源补料优化后，GABA的最高产量为9．91 g／L。 最后，利用已经获得的培养基最优配方和发酵罐最优条件，进行红曲菌X27的300L 发酵实验，即产业化中试。与小型发酵罐相比，大型发酵罐的氧气利用率提高，容积传 氧系数KLa的数值增长相对较慢(随着罐体内装液面的增高，KLa的数值增长速率随之 氧系数KLa的数值增长相对较慢(随着罐体内装液面的增高，KLa的数值增长速率随之 减慢)，使得中试需要在小型发酵罐发酵参数的基础上对生产一定的调控。通过实验最终 确定，在发酵前期(12 h内，)增加搅拌桨速率，可提高发酵液溶氧量，刺激菌体生长， 但搅拌桨转速不可超过250 r／min，以免过大的剪切力伤害菌体。在发酵中期(24 h前后)， 适量添加葡萄糖能改善发酵罐内pH，抑制pH快速上升对菌体的毒害作用。 关键词：红曲霉；丫一氨基丁酸；深层发酵；优化；产业中试 i 0 Ⅱ BREEDING BREEDING OF HIGHER?-AMINOBUTYRIC ACID—PRODUCING MONASCUS AND OPTIMIZATIO