高表达ACE2的MSC对ALI肺微血管内皮细胞和肺损伤的修复作用及机制研究-内科学专业论文.docxVIP

东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名：唆统角 日期： 秒，坼J·Jg 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布(包括以电子信息形式刊登)论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文 的公布(包括以电子信息形式刊登)授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：蛳导师签名。宴单盛期：世、，妒 万方数据  中文摘要 高表达ACE2的MSC对ALl肺微血管内皮细 胞和肺损伤的修复作用及机制研究 东南大学医学院附属中大医院重症医学科 博士研究生：贺宏丽博士生导师：邱海波教授主任医师 摘要 第一部分慢病毒介导的高表达ACE2的MSC细胞株的构建及鉴定 目的：构建慢病毒介导的长期稳定高表达血管紧张素转换酶2 (Angiotensin．converting enzyme 2，ACE2)I拘／],鼠骨髓来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)细胞株。 方法：(1)采用贴壁法原代分离培养C57BL／6小鼠骨髓来源的MSC，并通过倒置显 微镜观察细胞形态、流式细胞学检测表面标志物和诱导成脂、成骨分化对其进行鉴定。 (2)采用第三代自身灭活的免疫缺陷病毒作为慢病毒表达载体骨架，人翻译延长因子1 A 作为启动子，利用Gateway克隆技术通过BP重组反应构建pDown．mACE2，然后通过 LR重组反应将ACE2基因克隆人慢病毒表达载体中获得高表达ACE2的慢病毒表达载 体pLV．EX3d．P／neo．EFlAmACE2IRES／eGFP，与ACE2基因共表达的增强型的绿色 荧光蛋白(eGFP)作为报告基因，表达载体在另外三个辅助质粒：pLV／helper．SL3、 pLV／helper．SL4、pLV／helper—SL5辅助下在293FT细胞中进行包装，获得滴度较高的慢 病毒，将重组慢病毒转染4．7代的MSC，用G418进行抗药基因塞选纯化，从而获得纯 度较高的携带了eGFP和ACE2的MSCMSC．ACE2)及仅携带了eGFP的空白对照 MSC(MSC．GFP)，通过荧光显微镜及流式细胞仪检测MSC在转染后以及稳定传代30 代以上后的eGFP表达阳性率以评估MSC的转染效率。通过逆转录聚合酶链反应 (Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和Westem blotting法检测转 染后MSC的ACE2基因和蛋白表达水平，用ELISA法检测转染后MSC培养基中可溶 万方数据  东南大学博士学位论文 性ACE2蛋白的表达。(3)通过体外诱导MSC、MSC．GFP、MSC．ACE2向脂肪细胞、骨 细胞分化，评估基因转染对MSC多项分化潜能的影响；MTT法比较MSC、MSC．GFP、 MSC．ACE2增殖能力，评估基因转染对MSC增殖的影响；Transwell小室迁移实验检 测MSC、MSC．GFP、MSC．ACE2的迁移能力，评估基因转染对MSC迁移能力的影响。 结果：(1)成功分离培养原代C57BL／6小鼠骨髓来源的MSC，细胞呈长梭形，极性 生长，生长旺盛；流式细胞学检测MSC表形，MSC表达Sca．1、CD29、CD34、CD44， 不表达CDl 17；多项分化潜能检测MSC可体外诱导分化为脂肪细胞和骨细胞。(2)慢病 毒介导的高表达ACE2的MSC，荧光显微镜观察转染后转染效率高达95％以上，稳定 传代培养30代后，流式细胞仪检查其转染效率仍高达86％．94．3％； 与未转染的MSC 相比，ACE2高表达的MSC其ACE2 mRNA水平、膜型ACE2蛋白及可溶性ACE2蛋 白水平均显著增高，分别是未转染细胞的4倍、1．9倍和2．6倍(P值均0．05)。(3)ACE2 基因转染前后，MSC成骨成脂分化、增殖、迁移能力均无显著差异。 结论：慢病毒载体介导的ACE2基因转染能高效转染原代骨髓来源的MSC，转染 后的MSC可稳定高表达ACE2蛋白，并且其成骨和成脂分化、增殖和迁移能力无明显 影响。 万方数据  中文摘要 第二部分高表达ACE2的MSC对膳多糖诱导的肺微血管内皮细胞损伤的 保护作用的研究 目