第10讲医动物细胞培养生物制药II.ppt

本节关键问题 1.了解常用的大规模培养的动物细胞株特点 2.了解适合动物细胞大规模培养的生物反应器 3.重点掌握微载体培养技术 4.了解动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺 一 适合大规模培养的细胞株 1.细胞系(Cell line) 是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。 不能连续培养的为有限细胞系(Finite cell line)，能连续培养下去的为连续细胞系(Infinite cell line)。 2.细胞株(Cell strain) 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。 细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。 毛细管法 ------形成单个细胞克隆的细胞群体 有限稀释法 3.适合工业化生产的细胞株 包括： 原代细胞、传代细胞 有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理想的药物生产细胞） 二倍体细胞、异倍体细胞 融合细胞、转化细胞、基因工程细胞 贴壁型、非贴壁型 （1）原代细胞 鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液淋巴细胞 1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞生产脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进行生物制药的先河。 具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等缺点。 药物筛选、药理研究。 （2）传代细胞 二倍体细胞：具有正常细胞的特点：二倍体染色体、具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。有限细胞系（传代次数一般都不超过50代）。 WI-38： 1961年Wister 38研究所从女性高加索人的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI-38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用于生产的二倍体细胞,对病毒敏感，第一个用于疫苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。 MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。 （3）转化细胞 细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由有限性细胞系转化为连续性细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖。 倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低。 由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体，失去正常细胞的特点，开始时由于安全性不能确认而没有大量使用。随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20世纪80年代获得批准用于生产。 转化方法 1.细胞自转化 体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。 2.人工诱发转化 采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。 CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。 CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator，tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virussurface antigen, HBsAg）、粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor,GCSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。 BHK-21细胞（Baby hamster kidney cell）：是1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白(例如重组凝血因子VIII)。 Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。 （4）融合细胞 杂交瘤细胞：脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞。 无血清培养基中高密度悬浮生长。 抗体药物生产。 二 动物细胞大规模培养 1962年开始大规模培养尝试，目前已经成为生物制药的重要支撑技术。 疫苗、抗体、蛋白类药物等。 （一）定义 （二）转管/瓶培养系统 （三）动物细胞生物反应器培养 除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。 由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。 问题讨论： 1.如何设计生物反应器，降低动物细胞培养的剪切力损伤？ 2.如何满足细胞贴壁要求又能充分利用反应器空间体积？ 动物细胞培养的