dna去甲基化增强人牙周膜干细胞成骨能力并逆转其在高糖环境下受损的成骨潜能-颌面外科专业毕业论文.docxVIP

西南医科大学硕士学位论文测其多向分化能力；通过免疫荧光细胞化学染色检测细胞角蛋白 西南医科大学硕士学位论文 测其多向分化能力；通过免疫荧光细胞化学染色检测细胞角蛋白 (CKl4)和波形丝蛋白(Vimentin)以验证其间充质细胞特性；通过流 式细胞术(FCM)检测间充质细胞表面抗原以排除造血细胞、单核细 胞等混入对试验结果造成影响。结果：获得的hPDLSCs能成功诱导出 矿化结节、脂滴及神经细胞样突起；Vimentin染色阳性，CKl4染色 阴性；流式检测没有出现造血或单核等其他来源的细胞。结论：经鉴 定，分离出的目的细胞具有多向分化能力并为间充质来源的干细胞。 第三部分DNA甲基化抑制剂5-aza．dC在高糖环境下对 hPDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影响 目的：明确甲基化抑制剂在高糖环境下对hPDLSCs甲基化程度 及成骨向分化能力的影响。方法：通过向培养液中加入葡萄糖 (30mM)、DNA甲基化抑制剂5-aza．dC(1州)，将人牙周膜干细胞 随机分为四组：高糖组、抑制剂组、高糖加抑制剂组及对照组。在成 骨诱导液中分别培养4天后运用实时定量逆转录聚合酶链式反应实 验(Real．time RT-PCR)检测高糖组和对照组甲基化相关基因(Dnmtl、 Dnmt3a和Dnmt3b)变化，并分别于3天和7天提取四组DNA行整 体甲基化水平检测。检测四组细胞在成骨诱导液中培养3天及7天时 碱性磷酸酶(ALP)活性，茜素红染色检验四组细胞体外培养2周后 矿化结节形成状况，提取四组细胞3天和7天时的mRNA和总蛋白， RT-PCR检测成骨分化相关标志基因(ALP、OCN、OPN和OSX)的 表达情况，蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测骨向分化相关蛋白 万方数据 西南医科大学．硕士学位论文(ALP、OPN和0SX)的表达情况。结果：高糖组Dnmts的表达及 西南医科大学．硕士学位论文 (ALP、OPN和0SX)的表达情况。结果：高糖组Dnmts的表达及 DNA整体甲基化程度较对照组明显升高，抑制剂组降低DNA甲基化 程度的同时能降低高糖环境下升高的甲基化程度；在成骨诱导条件 下，抑制剂组相较于其他三组在ALP活性、矿化结节形成量、成骨 向分化标志基因及蛋白表达(ALP、OCN／OCN、OPN／OPN、伏洌OSx) 均明显增高，高糖和抑制剂组检测指标次之，高糖组检测指标均最低。 结论：在高糖环境中，hPDLSCs的甲基化程度升高并伴随着成骨向 分化能力的减弱，DNA甲基化抑制剂5-aza．dC能逆转高糖环境下被 削弱的成骨潜能。 第四部分5-aza-dC通过经典Wnt信号通路逆转hPDLSCs在 高糖环境下受损的成骨能力 目的：探讨经典Wnt信号通路参与高糖环境下5-aza．dC调控 hPDLSCs成骨分化过程中的机制。方法：Western blot分别于3天和 7天检测高糖组、抑制剂组、高糖加抑制剂组和对照组中经典Wnt 信号通路中胞内信号分子13-catenin(non—P active)和p-GSK一3p以及细 胞核转录因Left表达量；加入经典Wnt通路胞外抑制剂DKKl (100ng／m1)，采用Western blot分别于1天和3天检测抑制剂组、DKKl 组、高糖组、抑制剂加DKKl组、高糖加抑制剂组、高糖加DKKl 组以及高糖加抑制剂及DKKl共处理组成骨向分化标志蛋白(ALP、 OPN和0Sx)的表达情况。结果：高糖组中经典Wnt信号通路相关 因子水平表达降低，抑制剂组中相关因子表达升高并可逆转高糖对经 万方数据 西南医科大学硕士学位论文典Wnt信号通路的抑制作用，差异具有统计学意义(PO．05)；加入 西南医科大学硕士学位论文 典Wnt信号通路的抑制作用，差异具有统计学意义(PO．05)；加入 DKKl后，hPDLSCs成骨向分化标志蛋白表达量降低，DKKl加抑制 剂组以及高糖和抑制剂及DKKl组成骨向分化标志蛋白表达量明显 降低，差异具有统计学意义(PO．05)。结论：5-aza．dC通过经典Wnt 信号通路逆转hPDLSCs在高糖环境下受损的成骨能力。 关键词：高糖；DNA甲基化；人牙周膜干细胞；经典Wnt信号 通路；成骨向分化 万方数据 西南医科大学硕士学位论文DNA 西南医科大学硕士学位论文 DNA Demethylation Enhances the Osteogenic Differentiation Potential of Human Periodontal Ligament Stem Cells and Rescues the Inhibitory Effect of High Glucose Abstract Part I．Establishment of the diabet