egfpamam靶向递送mdr1sirna逆子宫肉瘤细胞多耐药的研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 硕士学位论文 瘤细胞中，谓之为受体介导的肿瘤靶向给药系统，此法可以显著提高药物输送 的有效性和靶向性。PAMAM分子高密度表面功能基团为肽、生物素等的修饰提 供了丰富的作用位点，进而利用受体．配体结合的特异性提高PAMAM分子递送 的靶向性。目前研究较为广泛的靶点主要包括EGFR、Her2分子等。已有研究 证实，通过对PAMAM表面功能基团进行活性多肽EGF修饰，可将siRNA分子 特异性递送至细胞表面过度表达EGFR的肿瘤细胞中，这为受体介导的PAMAM 分子靶向递送核酸类物质提供了广阔的应用前景。 但在子宫肉瘤细胞中，是否可以通过EGF—PAMAM递送系统将靶向MDRl 基因的siRNA递送至细胞中，探讨其特异性沉默MDRl基因及其下游分子表达， 进而联合临床化疗药物发挥其促进细胞凋亡等生物学作用，这些都有待于进一 步证实。因此，本课题拟以子宫肉瘤耐药细胞(MES—SA／DX5)为研究对象，设 计靶向EGFR的PAMAM．siRNA递送系统，利用自组装技术构建高效低毒 EGF—PAMAM—MDRl一siRNA复合物，通过RNAi技术下调MDRI基因的表达逆 转多药耐药现象，同时联合临床经典化疗药物紫杉醇，观察siRNA类基因物质 联合化疗药物对子宫肉瘤耐药细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响。 目的 l、通过分子自组装技术构建高效靶向基因复合物EGF．PAMAM-MDRl— siRNA： 2、考察EGF．PAMAM—MDRl．siRNA基因复合物在MES．SA／DX5中的入胞 情况； 3、考察MDRl基因的体外沉默效应(mRNA和蛋白水平)； 4、联合临床经典化疗药物紫杉醇，考察基因物质联合化疗药物对 MES．SA／DX5细胞增殖、凋亡和迁移的影响。 方法 1、基因复合物的制备：根据实验室前期研究结果，基因复合物PAMAM表 面胺基与siRNA表面磷酸基团的最佳比例(N／P)为20：l，siRNA．．EGF修饰 III 万方数据  摘要 物质量kL=2：1。将EGF、PAMAM、siRNA分别与相应体积的Opti—MEM混匀， 分别制成对应的A、B、c液。制成PAMAM—MDRl一siRNA二元基因复合物，则 将B液缓慢加入C液中，轻轻混匀，室温静置20 min。制成 EGF．PAMAM-MDRI．siRNA三元基因复合物，则将A液缓慢加入B液与C液的 混合物中，室温静置20rain。 2、 基因复合物的细胞转染及其对细胞生长状态的影响：MES—SA／DX5细胞 铺板至相应培养板，置于37。C、5％C02培养箱中孵育过夜。弃旧培养基，1xPBS 与Opti—MEM培养基各清洗一次细胞，将据1所述方法制备的基因复合物加入 细胞培养板，6 h后换完全培养基，置于37℃、5％C02培养箱中继续培养18 h 或42 h。于转染后0 h、6 h、24 h、48 h后，将细胞置于倒置显微镜下观察细胞 生长状态。 3、 激光共聚焦显微镜(Confocal)考察基因复合物的入胞：所用siRNA经 Cy5标记。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育18 h后，弃旧培养基，加 入Honechest 33342染液1 m1．,／孑L，孵育10 min后于Zeiss LSM 710倒置激光扫 描共聚焦显微镜下观察Cy5．siRNA进入IVIES．SA／DX5细胞情况。 4、RT-PCR、Western Blot、流式细胞术和Confocal考察基因复合物对 MES—SAJDX5细胞中MDRl基因的沉默效应：所用siRNA为MDRl一siRNA。经 基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育42 h后收集所有的细胞，或提取所有细 胞的RNA或蛋白。所提取的RNA逆转录为cDNA继而进行聚合酶链式反应， 经核酸电泳后分析MDRl基因mRNA表达情况。所提取的蛋白经BCA蛋白定 量试剂盒测定浓度后进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显色后分析P一印蛋白 表达情况。所收集的细胞直接加入F1TC标记的鼠抗人P—gP IgG，4℃暗处孵育 30 min后立即用流式细胞仪检测P—gp蛋白的平均荧光强度。经基因复合物转染 的细胞在培养箱中孵育42 h后弃旧培养基，加阿霉素溶液(ADM)500 pU孔(10 og／mL)继续孵育4 h后弃ADM加Honechest 33342染液500 IIL／孔孵育10 min， 经Zeiss LSM 710倒置金属激光扫描共聚焦显微镜观察MES．SADX5细胞对 Ⅳ 万方数据  硕士学位论文 ADM的摄取情况，侧面验证MDRl基因的沉默效应。 5、 Western Blot检测基因复合物与Taxol联用对MES．SA／DX5细胞凋亡相 关蛋白(Bcl一2，Caspase一3)表达的影响：经基因复合物转染