eb病毒潜伏膜蛋白1胞外区融合蛋白的表达及其在血清学检测中的应用-耳鼻喉头颈外科专业毕业论文.docxVIP

南京医科大学硕士学位论文EB病毒潜伏膜蛋白l胞外区融合蛋白的表达 南京医科大学硕士学位论文 EB病毒潜伏膜蛋白l胞外区融合蛋白的表达 及其在血清学检测中的应用 中文摘要 鼻P因癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是鼻咽上皮来源的恶 性肿瘤，在我国南方具有很高的发病率，对NPC的血清学和组织活 检及EB病毒(Epstein．Barr Virus，EBV)的基因表达检测都表明：EB 病毒不仅与鼻咽癌的发病密切相关，而且对其发生发展起重要作用。 EB病毒潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein 1,LMP．1)能够 在鼻咽癌患者的鼻咽拭子分泌物检测到。临床研究中，应用PCR技 术检测鼻咽拭子分泌物诊断鼻咽癌，其灵敏度和特异度分别为94．5％ 和100％。LMP．1在EBV致瘤机制中发挥关键性的作用：它能使B 淋巴细胞永生化和鼠纤维母细胞的细胞形态改变；在Rat．1细胞上， LMP一1使其血清依赖性降低、接触抑制和粘附作用丧失，接种裸鼠内 可形成肿瘤。LMP．1在鼻咽癌细胞普遍表达，并与鼻咽癌的进展呈正 相关，因此，LMP．1在鼻咽癌的形成中具有重要的生物学意义。 基于疫苗技术的发展，EBV特异性的CD8细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocytes，CTL)被认为是治疗EBV相关的鼻口因癌 (NPC)和复发性霍杰金病(HD)首选方案。EBV表达的LMP．1与 LMP一2是仅有的两种适合于治疗性强化NPC和HD患者CTL反应的 目标抗原。因此，为了增强其抗原性，本研究选用了LMP．1胞外区作 为目的蛋白进行原核表达，为进一步制备LMP一1抗体制备及研究 南京医科火学硕士学位论文LMP一1的生物学活性奠定基础，同时抗原也有望应用于临床检测。 南京医科火学硕士学位论文 LMP一1的生物学活性奠定基础，同时抗原也有望应用于临床检测。 方法： 1．合成LMP。l胞外区蛋白核酸序列； 2．用BamH I和眈出I将含LMPl胞外区重组基因的质粒 pMDl8一LMPl双酶切后，将胞外逸片段克隆到pGEX一4-2中； 3．重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，以异丙基硫代．岱-D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合 蛋白； 4．表达的蛋白经谷胱甘肽S．转移酶柱亲和层析纯化； 5．收集鼻咽癌患者的血清； 6。纯化的蛋白经Western blot法检测鉴定； 7．ELISA方法检测17位鼻咽癌病人血清中抗体。 结果： 1．重组表达质粒pGEX．LMPl经酶切鉴定为阳性，核酸序列分析 正确。 2．SDS．PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子 GST-LMP。l胞外区融合蛋白分子质量约为32．2ku。 3．Westem blot结果表明此抗原能够与鼻咽癌患者血清中抗体特 异性结合。重复实验三次，共检测了王7份临床上确诊的NPC 患者，其中的13份可检测出针对重组蛋白的抗体，而lo份健 康人血清未检出抗体，检出率76．5％。 4．ELISA方法检测鼻咽癌病人血清中抗体。重复实验三次，共检 测了17份临床上确诊的NPC患者，其中的ll份可检测出针 4 南京医科大学硕士学位论文对重组蛋白的抗体，而10份健康人血清未检出抗体，检出率 南京医科大学硕士学位论文 对重组蛋白的抗体，而10份健康人血清未检出抗体，检出率 64．7％。 结论： 成功制备LMPl胞外区重组基因表达的蛋白，并证明原核表达 的LMPl胞外肽段保持了原有的抗原性，能够与EBV相关鼻咽癌患 者血清中的抗体特异性结合。 关键词： 鼻咽癌；EB病毒；LMPl(潜伏膜蛋白1)；胞外区；免疫学 检测 南京医科火学硕士学位论文Expression 南京医科火学硕士学位论文 Expression and Purification of GST-·LMP-—1 Extracellular Domain Fusion Protein of EB Virus AB STRACT Nasopharyngeal carcinoma fNPC)is malignant tumor derived from nasopharyngeal epithelium cell．Its incidence is hi。gh in certain regions such as south-east Asia，especially in the south of China．The serum detection of EBV infected patients and tissue biopsy have been provided insight to the contribution of EBV an