eb病毒lmp2t b细胞重叠表位的预测 筛及鉴定.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 温州医学院硕士论文EB 温州医学院硕士论文 EB茄莓LMP2 T、B细胞重叠表位的预测、筛选和鉴定 中文摘要 目的： 基于本实验室对EB病毒(Epstein．Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2fEB Latent membrane protein 2,LMP2)B细胞表位筛选的结果，对已筛选的3个免疫优势B细 胞表位及其上下游的氨基端肽段预测其T表位，进一步筛选和鉴定EBV LMP2 T、 B细胞重叠表位，为其单克隆抗体的制备及EBV相关肿瘤免疫防治研究提供理论 依据。 采用SYFPEITHI细胞表位在线预测服务(http：／／www．syfpeithi．de／)。运用 SYFPEIn缸服务器上的EPITOPE PREDICTION方法，在本实验室已筛选的3个B细 胞优势表位及其上下游分析预测MOMP的HLA．A*0201限制性细胞毒T细胞 (cytotoxicity T cell，CTL)表位。根据筛选肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助 残基或优势残基进行记分，选择分值较高的氨基酸肽段为免疫优势T细胞表位， 即为EBV LMP2 CTL表位和B细胞重叠表位，并进一步对筛选的T、B细胞重叠表 位进行鉴定和免疫效应的研究。 方法： 1．EBV LMP2 HLA—A*0201限制性CTL和B细胞重叠表位的预测 从SwissProt蛋白数据库获得EBVLMP2的氨基酸序列，以数据库Syfpeithi、 NetCTL为主、并结合HLA．Bind、Rankpep等在线软件，对本实验室已鉴定的3个 EBV LMP2免疫优势B细胞表位及其上下游肽段，分别预测EBV LMP2中 HLA．A*0201限制性CD8+CTL表位，结果其中2个B细胞表位上下游分别重叠含 CTL表位，选择CTL和IB细胞表位重叠的EBV LMP2中的氨基酸短肽，作为T、B 细胞重叠优势表位为目的表位进行鉴定，并进一步进行免疫效应的研究。 2．表位肽的合成 由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案进行合成，采用 高效液相色谱法IqPLC纯化及进行质谱法分析鉴定。 3．CTL和B细胞重叠表位肽的鉴定 对上述合成的CTL和B细胞重叠表位肽作进一步鉴定。 (1)重叠表位肽的CTL表位活性鉴定：①利用T2细胞分析预测的重叠肽与 HLA．A*0201分子结合的亲和稳定性：②利用乳酸脱氢酶(LDH)释放法，检测重叠 温州医学院硕士论文表位肽诱导的体外细胞毒杀伤活性； 温州医学院硕士论文 表位肽诱导的体外细胞毒杀伤活性；③通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色 (ICS)方法，检测重叠表位肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN，水平，鉴定EBV LMP2的HLA-A*0 201限制性CTL表位的活性。 (2)重叠表位肽的B细胞表位活性鉴定：利用动物免疫的方法，即采用纯化 的合成肽偶联BSA，在BALB／C雌性小鼠(5只／组)后背部皮下多点免疫注射，以 沙眼衣原体(ct)主要外膜蛋白(MOMP)表位肽偶联BSA为对照，共免疫3次，间隔 两周，于免疫第0w，1w，3w，5w，7w，9w周分别收集血清，制备免疫血清抗 体。采用间接ELISA方法检测重叠表位肽在不同免疫时间段的抗体效价，免疫原 性，及其诱导抗体与EBV抗原的结合能力是否受CTL表位存在的影响。 结果： 1．CTL和B细胞重叠表位预测结果及初步筛选 根据Syfpeithi预测，以本实验室对EBV LMP2的B细胞表位鉴定结果为基础， 选择含分值较高的HLA-A*0201限制性CTL表位RIEDPPFNSL(199～2081、 LSSTEFIPNL(383-392)作为目的CTL和B细胞重叠表位肽，分别命名为EBpl3、 EBpl4。同时以HLA．A241j艮锖tJ性表位肽TYGPVFMCL(419～427)作为阴性对照， 以HLA—A*0201限制性CTL表位肽LLWTLVVLL(329～337)作为阳性对照，分别命 名为EBpl 1N EBpl2。 2．重叠表位肽的合成 由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案合成，经高效液 相色谱法HPLC纯化，以此获得纯度接近或高于95％的肽产物，经质谱法MS鉴定 氨基酸的序列，同时测定分子量，所得测定值与理论值相符。成功获得了高纯度 的合成肽EBpl 1、EBpl2、EBpl3矛IEBpl4，为进一步表位鉴定奠定了基础 3．重叠表位肽的进一步鉴定 (1)肽亲和稳定实验结果：显示重叠表位肽EBpl3、EBpl4与T2细胞的结合 亲和力(FI)分别为3．21、2．24，稳定性DC50均8h；阳性肽EBpl2与阴性肽 EBpll的亲和力(FI)分别为5．00和1．58，稳定性DC50分别为8h和2h。 本实验筛选的