miR181a5p通过下调基质金属蛋白酶14抑制性肿瘤的细胞迁移和血管生成.docx

博士学位论文 材料与方法 在第一部分的研究中，我们采用基因芯片数据库数据挖掘技术、激光捕获 显微切割技术、Real time PCR并H免疫组织化学染色方法，对MMP一14在来自不同 器官的不同恶性肿瘤中的表达水平以及MMP一14在恶性肿瘤组织(包括浸润前缘 的恶性肿瘤细胞)和癌旁正常组织中的表达情况进行了系统的检测与分析，验 证了MMP．14在多种人类恶性肿瘤中的表达上调情况，阐明了MMP-14表达分布 与恶性肿瘤细胞侵袭浸润状态之间的相关性。 在第二部分的研究中，我们采用生物信息学分析、DNA构建体构建、慢病 毒系统、Real time PCR、蛋白免疫印迹和双荧光素酶实验的方法，对MMP一14的 潜在调节者进行了预测，证实fmiR．181a．5p能够干扰异位表达的MMP-14，且 能够通过直接靶定MMP．14信使RNA的3’UTR从而对MMP一14的表达发挥负性调 节作用。 在第三部分的研究中，我们采用DNA构建体构建、慢病毒系统、明胶酶?? 分析、蛋白免疫印迹、Transwelldx室细胞迁移实验、基于圆点的2D细胞迁移实 验、基于圆点的3D细胞侵袭实验、大体手工刮取技术、Real time PCR、细胞表 面生物素酰化实验、鸡胚绒毛尿囊膜侵袭实验和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验 的方法，探索TmiR．181a．5p对MMP．14功能的影响，证实TmiR—181a-5p能够抑 制MMP．14介导的细胞迁移、细胞侵袭以及血管生成。 结果 1．MMP．14在多种人类恶性肿瘤中表达上调 人类恶性肿瘤细胞中表达上调的MMP．14己被证实能够促进肿瘤的生长和 转移。尽管MMP．14在多种恶性肿瘤中均被报道为表达上调，但迄今为止仍然没 有关于MMP．14在来自不同器官的不同恶性肿瘤中表达水平的系统分析。通过挖 掘基因芯片数据库Oncomine(癌症分析数据库)，我们评估了MMP一14在人类恶 性肿瘤标本中的表达水平。当P值被赋值限定在小于0．01时，相较于各自的非恶 性对照组织，大量的恶性肿瘤展现出了MMP．14的显著表达上调。 为了验证数据挖掘结果，我们检测了MMP．14在人类乳腺癌标本中信使RNA III 万方数据  中文摘要 与蛋白的表达水平。我们采用本课题组既往使用的激光捕获显微切割技术采集 了乳腺癌细胞和癌旁正常上皮细胞，然后行Real time PCR检测其中的MMP一14信 使RNA水平。我们的数据表明，MMP．14选择性地表达于人类乳腺导管原位癌和 浸润性导管癌中，而正常上皮则未见表达。MMP一14在浸润性导管癌中的表达水 平高于其在乳腺导管原位癌中的表达水平，尽管两者之间的差别没有统计学意 义。为了确认这个现象，我们使用抗．MMP．14抗体对相应的人类乳腺癌标本进 行了免疫组织化学染色。与Real time PCR的检测数据相一致，MMP．14蛋白仅在 人类乳腺癌细胞中被检测到，而并未在邻近的正常上皮细胞中被检测出来。 为了进一步证实我们数据挖掘结果所显示的MMP．14表达上调是～个恶性 肿瘤中的普遍现象，我们使用抗．MMP．14抗体对人类结肠癌标本进行了免疫组 织化学染色。我们观察到MMP．14在正常结肠粘膜细胞中表达量极少，而在位于 浸润前缘的恶性肿瘤细胞中却呈现了显著升高的染色强度。因此，我们的研究 表明，MMP．14在人类恶性肿瘤中显著表达上调，且其表达水平与恶性肿瘤的侵 袭浸润状态密切相关。 2．miR．181s被计算机预测为MMP一14的潜在调节者 MMP．14在人类恶性肿瘤中呈现显著表达上调，然而其表达上调的调节机制 仍然有待进一步阐明。当我们将包含有MMP．14 3UTR的MMPl4一GFP嵌合体 cDNA(MMPl4-GFP／3’．UTR)瞬时转染至低侵袭性人类乳腺癌细胞MCF．7*D高 侵袭性人类乳腺癌细胞MDA．MB．23 l时，我们注意到MMPl4．GFP在MCF．7细胞 中的表达弱于在MDA．MB．23l细胞中的表达。然而这种差异并没有在瞬时转染 了不包含MMP一14 3UTR的MMPl4．GFP嵌合体cDNA的细胞中被观察到。这个结 果也可在人类前列腺癌细胞LNCaP(低侵袭性)、DUl45幂I]PC3(高侵袭性)中 被重复出来，提示MMP．14信使RNA YUTR可能含有造成MMP．14在不同恶性肿 瘤细胞系中差异表达的调控序列。 众所周知，3UTR通常包含miRNA应答元件(miRNA response elements， MRE)，这些元件正是miRNAs能够与3’uTR相结合的序列。为了识)副MMP．14 信使RNA 3UTR上假定的miRNA应答元件，我们使用TargetScan搜寻其中潜在的 IV 万方数据  博士学位论文 miRNA应答元件。该分析显示，MMP一14信使