HIF1介导SCF表达调控参与胰腺癌细胞适应乏氧环境的基础研究.docxVIP

天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的 胰腺癌是一种主要来源于胰腺导管细胞的恶性实体肿瘤。近年来胰腺癌发病 率在国内外均呈稳固上升趋势，每10年增加15％左右。胰腺癌是目前预后最差的 消化系统肿瘤，五年生存率仅4％。尽管外科手术和化疗有很大的改进，但近20 年来胰腺癌患者的预后并未有明显改善。目前多项研究表明，缺氧是实体瘤中存 在的一种普遍现象，其作为应激原，可激活肿瘤细胞内的一系列基因对乏氧作出 应答反应，从而改变肿瘤生物学行为，如细胞增殖、细胞凋亡抑制、肿瘤血管 形成、能量代谢及侵袭转移等，使肿瘤适应乏氧微环境，增加了临床治疗的困 难。胰腺癌是一个典型的乏氧实体肿瘤，胰腺癌患者的CT检查常表现为肿瘤性 占位性病变的中心有缺血坏死低密度灶，并且在增强扫描时肿瘤坏死病灶无增 强，提示肿瘤内缺乏有效血管，处于缺氧状态。因此，乏氧状态下，对其相关 基因调控机制的研究，可能为胰腺癌有效治疗提供新的思路。 在众多参与细胞乏氧状态调控的转录因子中研究最深入的、作用最强的当属 乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)，其能特异性地结合于一种低氧反 应元件(hypoxia．responsive element，HRE)(5-RCGTG．3’)调节其靶基因的转 录活性，改变肿瘤细胞的生物学行为。有研究表明，低氧微环境可以诱导SCF 的表达，SCF是一种干细胞因子，表达于多种肿瘤细胞的表面，在肿瘤细胞增殖、 血管新生等方面有重要作用。因此，我们推测胰腺癌细胞在乏氧环境下可通过 HIF调节SCF的表达，参与肿瘤的发生、发展过程。通过相关的实验技术初步观 察胰腺癌组织中HIF．1与SCF表达相关性，验证乏氧环境下HIF．1与SCF之间的相 互调节关系及转录调控机制。 方法 一、 胰腺癌组织中SCF与HIF．1的表达情况 1．利用免疫组化方法检测SCF、HIF．1在胰腺组织中的表达，初步分析SCF 与HIF．1的表达相关性。 二、 胰腺癌细胞中HIF．1 Cc、c．kit的基础表达情况 1．本研究选择胰腺癌细胞系MIA PaCa．2、BxPC一3、PANC-l、Capan一1为 研究对象。采用流式细胞技术分析不同胰腺癌细胞中c．kit(CDll7)的 表达，为下一步实验选择合适的细胞系。  ??津医科大学硕士学位论文 2．静息状态下，提取胰腺癌细胞蛋白，应用Western blot方法检测不同胰 腺癌细胞中HIF．1(：c蛋白的基础表达情况； 三、明确乏氧状态下胰腺癌细胞中HIF．1与SCF表达水平及调节关系 1．实验选择胰腺癌细胞系BxPC．3、PANC．1为研究对象，采用1％02、 5％C02、94％N2混合气体对密闭培养箱中细胞进行不同时间乏氧培养。 2．应用细胞转染和小RNA干扰技术下调HIF．1a的表达后，分别应用 Western blot和RT-PCR检测不同处理条件下胰腺癌细胞中SCF、HIF．1a、 VEGF及内参[3-actin蛋白和基因的表达情况。 四、研究乏氧状态下HIF．1与SCF的相互作用形式以及转录调控机制 1．采用染色体免疫共沉淀技术(ChIP)明确HIF．1对SCF的调控形式。 2．应用HIF．1过表达载体、SCF基因启动子或突变的SCF基因启动子荧光 素酶表达载体，共同转染胰腺癌细胞，采用双荧光素酶分析法，定量检 测HIF．1调控SCF基因转录激活的能力。 结果 HIF．1和SCF在胰腺癌组织中的表达均明显高于正常胰腺组织，且两者呈正 相关。流式细胞技术结果显示BxPC一3、PANC．1高表达c．kit，结合western blot 结果选择BxPC．3、PANC．1作为体外实验研究对象；经过不同时间的乏氧处理 后，HIF．1与SCF蛋白在低氧环境下表达增加，并呈现同步性。通过RNA干扰 技术沉默乏氧诱导因子．1(HIF。1)的表达后，western blot及RT-PCR结果显示， 可以同时抑制SCF的mRNA与蛋白表达，而对照组没有抑制效果；进一步的研 究发现，HIF．1可以直接结合于SCF基因启动子区的乏氧反应原件(HRE)，并 且可以上调SCF启动子的转录活性。 结论 乏氧环境下HIF．1是调节SCF表达的关键转录因子；SCF是促进胰腺癌生 长和侵袭的重要细胞因子，HIF．1和SCF／c．kit信号通路可能成为治疗胰腺癌的 潜在靶点，为临床上有效的治疗胰腺癌提供新的思路。 关键词：胰腺癌乏氧乏氧诱导因子干细胞因子  天津医科大学硕士学位论文 Abstract Ubjective Pancreatic cancer is a malignant solid tumor which mainly comes from pancreatic ducts．I