抗cd1d分子抗体制作备及可溶性cd1d分子elisa方法建立.docxVIP

中文摘要【目的】 中文摘要 【目的】 (1)克隆人CDld编码基因； (2)制备人CDld胞外区重组蛋白及其特异性抗体； (3)制备人CDld a3结构域重组蛋白及其特异性抗体： (4)建立检测可溶性人CDld分子的ELISA方法。 【方法】 (1)通过RT-PCR克隆人CDld编码区基因，PCR产物连接T载体，DNA 测序鉴定。 (2)设计特异引物，分别扩增人CDld胞外区和人CDld a3结构域的编码基 因，通过酶切、连接，将目的片段插入原核表达质粒pET28，分别构建pET28／CDld 及pET28／CDld．a3表达载体。 (3)表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导重组蛋白表达，并 利用Ni．NTA层析柱纯化重组蛋白。 (4)分别将纯化的人CDld胞外区重组蛋白和人CDld a3结构域重组蛋白免 疫家兔和小鼠，分别制备兔抗人CDld胞外区抗体和鼠抗人CDlda3结构域抗体。 (5)以间接ELISA测定抗体效价，利用免疫组化和Western blot鉴定抗体的特 异性。 (6)利用SPA法纯化抗体，利用制备的上述抗体，建立双抗体夹心ELISA 法检测可溶性人CDld分子。 (7)利上述建立的ELISA方法，检测系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等患 者血清标本中的CDld分子的表达水平，并对其临床意义进行了初步分析。 【结果】 (1)成功克隆了人CDId分子编码区基因。 (2)成功构建了人CDld胞外区和人CDld a3结构域的原核表达载体 pET28／CD1 d及pET28／CD I d-a3。 (3)成功表达并纯化了人CDld胞外区和人CDld a3结构域的重组蛋白。 7 (4)成功制备了鼠抗人cDld及兔抗人cDld．c【3抗体，ELISA结果显示效 (4)成功制备了鼠抗人cDld及兔抗人cDld．c【3抗体，ELISA结果显示效 价都大于1：12800，免疫组化及Western blot分析表明所制备的两个抗体具有较 好特异性，不仅能与重组人CDld分子结合，也能与天然的人CDld分子结合。 (5)初步建立了检测可溶性人CDld分子的双抗体夹心ELISA法。 (6)用建立的ELISA方法检测系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等患者血清 标本，结果初步显示患者血清中存在较高水平的可溶性CDld分子。 【结论】 (1)成功克隆了人CDld编码区基因；(2)通过自行制备重组蛋白，成功制 各了效价较高的鼠抗人CDId胞外区和兔抗人CDld a3结构域的特异性抗体；(3) 利用自行制备的抗体，建立了可溶性人CDld分子ELISA检测方法。国内外尚 未见可溶性人CDld分子ELISA检测方法及其应用的研究报道，本方法的建立 为进一步研究CDld分子的生物学功能及其在疾病进程中的作用奠定了坚实基 础。 【关键词】 CDld；表达；抗体；制备；ELISA 8 Abstract[Objective] Abstract [Objective] To clone the DNA coding for the human CD l d(hCD l d)，express the recombinant human CD l d extracelluar regeion and the human CD l d-a3 domain，prepare the antibodies of mouse anti—hCD l d extracelluar regeion and rabbit anti．hCD l d．a3 domain，and establish the ELISA method for detecting the soluble CD l d． [Methods] (1)The DNA coding for the human CD l d was cloned by RT—PCR． (2)The DNA fragments coding for the hCD l d extracelluar regeion and the hCDl d—a3 domain wfire amplified by PCR and inserted into the vector pET28 respectively to construct the expression vectors pET28／CD l d and pET28／CD l d—a3． (3)The expression plasmids pET28／CDld and pET28／CDld—a3 were transformed into E．coli BL2 1(DE3)，respectively，and the recombinant proteins were