miRNA5025p对骨关节炎软细胞损伤的生物学作用及机制研究.docx

博士学位论文本研究旨在探讨miR．502．Sp在正常和OA软骨组织中的表达水平差异，进 博士学位论文 本研究旨在探讨miR．502．Sp在正常和OA软骨组织中的表达水平差异，进 而研究miR-502．5p对IL．1B诱导的软骨细胞损伤的生物学作用及其作用机制， 为OA疾病探寻新的治疗靶点并提供新的理论依据。 方法： 第一部分的工作是关于miR．502．5p在OA软骨组织中的表达及其生物学作 用的研究。首先，用RT-PCR方法检测了四个预测的miRNAs(miR-502．5p、 miR-138、miR-205、miR-146a)在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差异。 用胰蛋白酶及II型胶原酶联合消化法分离培养正常的软骨细胞，然后作不同处 理，分为四组：对照组，正常培养的软骨细胞；IL．1p组，用IL．1p处理的软骨 细胞；miR-502．5p mimic组，转染miR．502．5p mimic后再用IL．1 p诱导软骨细 胞；阴性对照组，转染miR-502．5p negative control后再用IL．1p诱导软骨细胞。 RT-PCR方法检测不同处理组miR-502．5p的表达水平差异。MTT方法检测不同 处理组的细胞增殖水平。流式细胞仪检测不同处理组的细胞凋亡水平。Westem blot方法检测不同处理组凋亡相关蛋白Bcl．2、Bax和Caspase．3的蛋白表达水 平。RT-PCR和western blot方法检测不同处理组促炎因子IL．6、TNF0【和IL．8 的表达水平。RT-PCR和western blot方法检测不同处理组ECM结构蛋白蛋白 聚糖和II型胶原、金属蛋白酶MMP．3、MMP．9和MMP．13的表达水平。 第二部分的工作是关于Wnt／13．catenin信号通路与miR．502．5p-p53调控回路 关系的研究。RT-PCR和western blot方法检测了p53在20组正常和OA软骨组 织中的表达水平差异。分离培养正常的软骨细胞，首先探究p53对miR-502．5p 的调控作用，对软骨细胞作不同处理后分为四组：对照组，正常培养的软骨细 胞；IL．1p组，用IL．1p处理软骨细胞；si—p53+IL-1p组，转染p53 siRNA，再 用IL．1D诱导软骨细胞；阴性对照组，转染p53 negative control，再用IL一1p诱 导软骨细胞。western方法检测不同处理组p53的蛋白表达水平差异。RT-PCR 检测不同处理组miR．502．5p的表达水平差异。然后构建miR．502．5p启动子的 荧光素酶报告载体，荧光素酶报告实验研究p53对miR-502．5p的转录调控作用。 III 万方数据 摘要然后探讨miR．502．5p对p53的调控作用，将细胞随机分为四组：对照组、IL．1B 摘要 然后探讨miR．502．5p对p53的调控作用，将细胞随机分为四组：对照组、IL．1B 组、miR．502．5p mimic组和阴性对照组。RT-PCR和westem blot方法检测不同 处理组p53的蛋白表达水平。构建p53 Y-UTR的荧光素酶报告载体，荧光素酶 报告实验研究miR．502．5p对p53的调控作用。进一步探究Wnt／p．catenin信号通 路对p53的调控作用。RT-PCR和westernblot方法检测了Wntl、Wnt3a和 13-catenin在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差异。胰蛋白酶及II型胶原 酶联合消化法分离培养正常的软骨细胞，作不同处理，分为三组：对照组即正 常培养的软骨细胞；IL．1p组，用IL．1D处理软骨细胞；Wnt3a抑制剂组，加入 sFRP．3和Dkk．1，再用IL。1 B处理软骨细胞。western blot方法检测Wnt3a、 13-catenin和p53的蛋白表达水平。 第三部分的工作是关于miR．502．5p的靶标基因及相关通路的研究。RT-PCR 和westem blot方法检测了TRAF2在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差 异。胰蛋白酶及II型胶原酶联合消化法分离培养正常的软骨细胞。构建TRAF2 3-UTR的荧光素酶报告载体，荧光素酶报告实验研究miR-502．5p对TRAF2的 调控作用。分离培养正常的软骨细胞，随机分为四组：对照组、IL．1P组、 miR-502．5p mimic组和阴性对照组。RT-PCR和western blot方法检测不同处理 组TRAF2的蛋白表达水平。随后探讨miR．502．5p是否通过靶向调节TRAF2 介导NF．r,B信号通路。分离培养正常的软骨细胞，作不同处理，分别五组：对 照组，正常培养的软骨细胞；IL．1p组，IL．1p处理软骨细胞；PDTC组，加入 NF．1cB抑制剂PDT