实验 一二三四----上 DNA重组技术.pptVIP

碱裂解法小量制备质粒DNA 一．实验目的及背景 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒的应用 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 本实验目的 本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。 分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 碱变性法基本原理 1. 溶菌酶 2. 碱裂解： SDS, NaOH pH 12.0-12.5 3. 中和： pH 4.8 醋酸钠 碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再进一步纯化质粒DNA。 实验方法 １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度。 ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清 ３．将细菌沉淀悬浮于250μl预冷溶液Ⅰ（已加入RNA酶）中，振荡混匀。 ４．加入250μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物。 ５．加入350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次。 ６．12000g 离心8 分钟，取上清移到吸附柱中离心1分钟。 ７．加入700μl 70%乙醇，１２000g 离心1分钟。 8 . 重复7 9 . １２000g离心2分钟 10．加入50μl 洗脱液至吸附膜中央，１２000g 离 心1分钟。 11．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖电泳。 12．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察。 注意事项 ＤＮＡ的酶切 一．实验目的及背景 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。 限制酶 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。 Ⅱ型酶 Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。 酶切反应注意事项： １．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。 ２．ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延