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乳酸脱氢酶及其说辅酶I的作用
乳酸脱氢酶及其辅酶I的作用 乳酸脱氢酶由酶蛋白和辅酶I组成,两者单独存在时,无催化活性,必须共同存在组成全酶才起作用。乳酸脱氢酶在各种组织细胞广泛存在,它可逆地催化乳酸脱氢形成丙酮酸或丙酮酸接受氢生成乳酸。在代谢过程中,有重要意义,反应中由辅酶I(NAD+)起传递氢作用。乳酸脱氢酶属于不需氧脱氢酶,不能直接将氢交给氧,反应中生成的还原型辅酶I,可与其它酶蛋白结合,将氢传给其它的递氢体,通过呼吸链被彻底氧化。 试验原理: 本实验以乳酸为底物。用新鲜的动物肌肉的粗制提取液,分别制成酶蛋白部分(用白陶土吸附除去辅酶I)和辅酶部分(加热破坏酶蛋白),观察两者单独作用及共同作用。实验中为了便于观察,用甲烯兰(即美兰)做为受氢体。已知甲烯兰能从还原型黄酶接受氢而由蓝色变成无色(甲烯白)。所以本实验中根据溶液兰色的消退判断乳酸脱氢反应的发生。 操作步骤: 1、分别制备酶蛋白提取液及辅酸I提取液 (1)除去辅酶I的酶蛋白提取液:取新鲜动物肌肉组织3g,剪碎放研钵中加玻璃砂约 0.5g,白陶土 0.5g,加 PH7.4 0.1M磷酸缓冲液8ml,研细成粥状。移入离心管中,以2000rpm离心5分钟,倾于另一试管中备用。 (2)辅酶I提取液:取蒸馏水10ml于中试管中,加热煮沸。取新鲜的肌肉组织3g,剪碎,放入沸水中,继续煮沸10分钟,为防止水分过多蒸发可加盖。稍冷后倾入乳钵中研细,移入离心管中2500rpm离心5分钟,取上清液备用。 3、充分混匀,向各管徐徐加入液体石腊5滴(避免与空气接触),静置试管架上或放37C水浴15’~30’,随时观察并记录各管退色情况,分析结果。 注: 1、乳酸脱氧生成的丙酮酸与KCN结合,不发 生其逆反应。 2、本实验中生成的甲烯白易被空气氧化又成 为甲烯兰,所以在加入液体石腊后观察褪 色时不宜振荡。 3、观察退色的管,振荡片刻会出现什么变 化?再放置一段时间有什么变化?解释这 些现象。 * * 2、取试管4只,标清管号,按下表加样: / 0.5 0.5 0.5 10 10 0.5 0.5 0.5 / 10 10 0.5 / 0.5 0.5 10 10 0.5 0.5 / 0.5 10 10 5%乳酸钠提取液(ml) 酶蛋白提取液(ml) 辅酶Ⅰ提取液(ml) 蒸馏水(ml) 0.5%KCN液(滴) 0.04%甲烯兰液(滴) 4 3 2 1
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