2018年大鼠脏器组织淋巴细胞分离方法.docVIP

大鼠脏器组织淋巴细胞分离方法 　　1.实验前准备 　　2.使用方法说明及图例 　　2.1血液样本分离液使用说明及图例 　　2.2组织分离液使用说明及图例 　　3.HES-TBD550使用说明 　　4.组织单细胞悬液的制备 　　5.注意事项 　　6.性能指标 　　7.生产企业 　　8.参考文献 　　1. 实验前准备 　　A．试剂 　　大鼠脏器组织淋巴细胞分离液（货号：LTS1083P）、全血及组织稀释液、细胞洗涤液 　　、羟乙基淀粉550、胎牛血清 　　B．器材 　　玻璃离心管、玻璃滴管 　　水平转子离心机、无菌工作台 　　2. 使用方法说明及图例 　　2.1 血液样本分离液使用说明及图例 　　A. 小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）： 　　a. 取新鲜抗凝血1-2ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀； 　　b. 小心加于与混合液等体积的细胞分离液之液面上； 　　c. 以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 　　第二层细胞放入含4- 　　5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心 　　20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B. 中量分离-使用5-10ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）： 　　a. 取新鲜抗凝血5-10ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀； 　　b. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）； 　　c. 以500g（约1800转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 　　第二层细胞放入含10ml 　　细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20 　　分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C. 大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血（分离图例见图例2）： 　　a. 取新鲜抗凝血20ml以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去血浆； 　　b. 向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）12ml 小心混匀； 　　c. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）； 　　d. 以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 　　第二层细胞放入含20ml 　　细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20 　　分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D. 大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血（分离图例见图例3）： 　　a. 取新鲜抗凝血50ml 　　30分钟。吸取混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。 　　b. 将步骤1中留取的上清液以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞； 　　c. 向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）20ml 小心混匀； 　　d. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）； 　　e. 以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 　　收集第二层细胞放入含20ml 　　细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20 　　分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。 　　注：提取率大于90%。 　　血液（人）中各细胞含量参考值：红细胞男：4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3) 　　白细胞 　　血小板 　　白细胞分类计 　　数女：3.5-5.0×10 　　12 　　/L(350-500万个/mm3)新生儿：6.0-7.0×1012/L(600-700万个/mm3)成人：4.0-10.0×109/L(4000-10000个/mm3)新生儿：15.0-20.0×109/L（15000-20000个/mm3)100-300×109/L（10万-30万个/mm3)名称占白细胞总数百分比嗜中性粒细胞30%-70%嗜酸性粒细胞0.5%-5%嗜碱性粒细胞0%-1% 　　淋巴细胞20%-40% 　　单核细胞3%-8% 　　分离图例3 　　抗凝血50ml与HES-TBD550 1：1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟 　　2.2 组织分离液使用说明及图例 　　A．取组织匀浆单细胞悬液（细胞浓度为2×108- 　　1×109个/ml，具体制备方法参照“4.组织单细胞悬液的制备”）2ml，小心加于2ml细胞分 　　离液之液面上； 　　B．以400g（约1500转/分