大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作.pptVIP

大肠杆菌高密度发酵 目录 大肠杆菌 大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的30%以上. 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,由于具有遗传背景清楚,目的基因表达水平高,技术操作、培养条件简单,抗污染能力强,大规模发酵经济等优点,倍受遗传工程专家重视,是目前应用最广泛,最成功的表达体系. 高密度培养技术 高密度培养技术：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。 培养基选择 LB培养基(种子培养基) :胰蛋白胨5g,酵母粉2.5g,NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH调节pH7.0, 2L三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭菌121℃, 20min,室温保存. TB培养基(发酵培养基) : 胰蛋白胨240g, 酵母粉480g, 甘油80g, 消泡剂1ml, 溶于H2O, 定容至19L,B. Braun发酵罐在位灭菌121℃, 15min. 培养基配制 配制种子固体培养基100mL ， 分装试管， 0.1MPa 灭菌20min，然后摆成斜面。 配制种子培养液600mL，分装50mL于一个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌。 培养方式 微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养，这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。 培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。 培养条件 1、温度：36~38 ℃ 2、pH： 7 3、搅拌速率：100~200r/min 4、溶氧: 20~50% 5、通风：2~3L/min 6、接种量：1~2% 操作步骤 1、菌种准备 2、上罐前的准备及实罐灭菌 3、发酵操作 4、发酵管理 5、发酵过程中各生化指标的测定 6、补料 7、放罐 8、清洗 菌种准备 1、上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜 面，37℃培养24h。 2、上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子 瓶， 37℃振荡培养12h，然后转接二级 种子瓶， 37℃振荡培养10h。 上罐前的准备及实罐灭菌 1、洗净发酵罐及各联接胶管 2、 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴泡敌。 3、校正pH电极和溶氧（DO）电极。 4、把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在位灭菌。 发酵罐 上罐前的准备及实罐灭菌 5、当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定在37℃，切入自动。 6、当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。 上罐前的准备及实罐灭菌 7、连接通气管路，将进气过滤器K7口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源， 对发酵罐进行通气， 调整空气流量3 ～5L/min。 8、当温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。 上罐前的准备及实罐灭菌 9、将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。 10、设定搅拌转速为300r/min、空气流量 2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。 发酵操作?? 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，进行如下操作：1、取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3 2、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打