感染性疾病地分子诊断.pptVIP

* T7RNA聚合酶（英语：T7 RNA Polymerase）是一种RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5→3方向的RNA形成过程。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。 此酵素在合成RNA的过程中，需要DNA模板与镁离子（Mg2+）作为辅因子。牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）及精胺（spermidine）对此酵素具促进效果。与细菌的RNA聚合酶的差异之一，在于T7RNA聚合酶不受抗生素立汎霉素（rifampicin）抑制。 T7 RNA Polymerase，即T7 RNA聚合酶，是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5→3RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。????特点：T7?RNA?Polymerase可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T7启动子有高度的特异性。????用途：用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay)，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。????来源：由大肠杆菌表达，表达基因为嗜菌体T7 RNA Polymerase基因。????活性定义： 37℃60分钟内，催化1 nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。????活性检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl2，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，0.6MBq/ml[3H]-ATP，20μg/ml plasmid DNA containing the specific T7 RNA Polymerase promoter sequence。????纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。????酶储存溶液：50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/ml BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。????Transcription Buffer(5X)：200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl2，50mM DTT，50mM NaCl，10mM spermidine。????失活或抑制：70℃加热10分钟可使T7?RNA?Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使T7?RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T7 RNA Polymerase的活性。????T7的consensus promotersequence如下：????-15 ?-10 ??-5 ??+1 ?+5????TAATACGACTCACTATAGGGAGA * An alternative method of RNA amplification, nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), is reported to specifically amplify RNA but not DNA (Heim et al, 1998). Since NASBA amplifies RNA using an RNA T7-polymerase promoter to generate multiple RNA products at 41°C, double stranded DNA is not denatured and consequently not amplified (Figure 1B) (Chan and Fox, 1999; Simpkins et al, 2000). NASBA has traditionally been used for the amplification of blood-borne viruses (Kievits et al, 1991; van Gemen et al, 1993), though it may also be useful for the detection of circulating tumour cells (Lambrechts et al, 1998, 1999). Potentially