胚胎工程实验之体外受精.ppt

动物胚胎工程实验 王子玉逸夫楼3084 实验二 小鼠卵母细胞的体外受精 对畜牧业生产、动物生殖机理的研究及保护濒危动物、治疗人类的不孕不育症等具有重要意义 可望解决胚胎移植所需胚胎的生产成本及来源匿乏等关键问题。可利用IVM－IVF－IVC体外大规模生 产高质量的胚胎，建立工厂化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎，大大加速品种改良进程。 能为动物克隆和转基因等其他胚胎生物技术提供丰富的实验材料和必要的研究手段 充分挖掘优良公母畜的繁殖潜力 评定家畜精子的质量 1978年 英国 由于正常受精过程的完成需要一个完全成熟的卵子和一个获得受精能力的精子，且其受精后需对其进行培养才能发育成为一个可移植的胚胎，因此，从广义上讲，体外受精技术又包含卵母细胞的体外成熟培养、精子的体外获能、体外受精、受精卵的体外培养等多项密切相关的技术。 一、实验目的 熟悉雄鼠的生殖器官的结构特点； 掌握从输卵管上取成熟卵母细胞的方法； 掌握从附睾尾部取精子的方法、精子的体外获能和体外受精方案、受精率的观察。 二、实验器材和材料 1. 器材及药品 体视显微镜，手术器械，1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔，血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 0.1％透明质酸酶，卵母细胞操作液（M2），精子操作液和受精液（T6），胚胎培养液（CZB，有糖和无糖）、激素（PMSG和HCG），石蜡油。 2．实验动物 3-4周龄昆明系雌性小白鼠和8-12周龄雄鼠，自由采食饮水，控光一周以上，暗光时间20：00-6：00；光照时间6：00-20：00。 三、实验内容 1．体内成熟卵母细胞的获取 超排方法：15：00腹腔注射PMSG10 IU/只小鼠。48小时后腹腔注射hCG10 IU/只。 注射hCG 后14-15h，利用颈椎脱臼法处死小鼠（方法同实验一），取输卵管于M2操作液中，清洗两次，在体视显微镜下用眼科镊子撕开输卵管壶腹部释放出卵丘卵母细胞复合体团，用口吸管吹打几次，把COC团分散开。 IVM卵母细胞（小鼠） 2．体外受精 2．1 取附睾尾部精子 选取性成熟（8周）昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有受精能力，颈椎脱臼法杀雄鼠，打开腹腔，将附睾尾部和输精管剪下，剔除脂肪，在实体显微镜下，用镊子和针头配合，挤出输精管内精子。针头刺破附睾尾部上皮，挤压出精子（图2-1）。 2．2精子的洗涤 在小鼠上可省略（从附睾尾部取精子），但在大动物上必需（射出精液），洗涤可除去获能抑制因子、卵黄、甘油等。 2．3精子的获能 马上收集精子团块，置于1.5mL离心管中，加入1mL含10mg/mLBSA的 T6，轻微振荡几次，使精子团分散开，用封口膜封口，于37.5℃，5％CO2，95％空气，100％ 湿度的CO2培养箱内中孵育1.5h左右。 2．4精液品质检测 主要检测活力和密度，方法参考《动物繁殖学实验教程》。 附：精液品质检查 精液品质检查 (semen quality measurement)是为了鉴别精液质量的优劣。评定的各项指标，既是确定精液取舍、新鲜精液进行稀释保存的依据，又能反映雄性动物饲养管理水平和其生殖器官的机能状态。 因此，常用作诊断公畜不育或确定其种用价值的重要手段，同时也是衡量精液在稀释、保存和运输过程中的品质变化和处理效果的重要判断依据。 指 标 精子活力 (motility) 精子活力是指精液中呈前迸运动的精子所占百分率，也称活率。由于它与精子的受精能力直接相关，所以是评价精液品质的一个重要指标。通常在采精后，精液处理前、后，冷冻精液解冻后和输精前进行检查 精子密度 每mL中精子的数目（细胞计数板） 精子顶体异常率 (abnormal acrosome rate)： 精子顶体在受精过程中具有重要作用，一般认为只有呈前进运动、且顶体完整的精子才具有正常受精能力。 精子畸形率 (ASR)： 凡形态和结构不正常的精子通称为畸形精子。在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但一般不会超20%。优质精液，精子畸形率不能超过如下数值:牛18%，水牛15%，羊14%，猪18%，马12%， 2．5体外受精 将成熟的COC移入已经平衡2h的受精滴中（T6+20mg/mL），加入适量体积的获能精子，使精子密度在1×106右，置于培养箱中孵育8h，观察原核形成和第二极体排出，计算受精率。 体外受精质量的评定 体外受精成功的判断指标： 精子穿透率 原核形成率 卵裂率 囊胚率 通过染色或胚胎培养 3．胚胎培养 洗去精子，将胚胎换液于无糖CZB继续培养。胚胎过阻断之后（4－cell）换为含葡萄糖的CZB，换液时间在有1/3的胚胎到达4－cell后进行，大约在受精后36h－48h之间。 在受精后24h、48h