鸡β防御素AvBD5真核载体构建及免疫活性的研究.docVIP

鸡P-防御素AvBD-5真核载体构建及免疫活性的研究 张树嘉林欣欣王柳 AvBD是禽类先天内源免疫防御系统重要组成部分。木文构建了 3个重组真核表达载体： pVAXl-AvBD5、pVAXl-SEp9 和井表达载体 pVAXl-SEp9-AvBD5。将 3 个重组质粒作为 DNA 疫苗免疫小鼠。用ELISA检测小鼠血清巾特异性IgG抗体水平，实吋荧光定MPCR法检测肠 组织屮MCP-1基因表达量差异；分离小鼠淋巴细胞，川流式细胞术分析T淋巴细胞亚群含量 变化。在酋免后第42天用肠炎沙门氏菌对小鼠攻毒，检测免疫保?护效率。结果表明 pVAXl-SEp9、pVAXl-SEp9-AvBD5均能在小鼠体内刺激免疫应答，产生抗SEp9的特异性抗 体，pVAXl-SEp9-AvBD5飢的IgG抗体OD450nm与对照组相比最高，达到0.33, M时能诱导肠 组织产生MCP-1，引起T淋巴细胞亚群增殖，与对照相比，最高分别为63.17%、43.11%、20.57%。 攻毒后pVAXl-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD5组屮小鼠新鲜粪便屮SE蘭落数与对照组相比 明显下降，pVAXl-SEp9-AvBD5组在攻毒后的第4天，粪便屮仅含SE 22.90CFU/g。木研究证 明了奶AvBD-5能竹效刺激鸡免疫防御系统，增加机体特兄性免疫应答能力，提高小鼠对SE 感染的保护效率。 关键词：鸡P-防御素；兑疫活性；DNA疫苗；真核载体；双顺反子 1.前言 抗微生物多肽(Antibacterial peptide，ABP)足生物机体受到外界微生物侵染吋內在防御系 统产生的一类防御性肽类活性物质，以对抗外源性病原体感染。抗谢肽富含阳离子氨基酸残 基，具柯广谱、高效的杀菌活性，被称为“第二防御体系”。 Harwig S等在1994年首次从鸡的嗜中性粒细胞中分离提取到3种相似抗菌肽，鸡p-防御 素(Gallinacin),分别命名为Gal-1、Gal-la和Gal-2。鸡基因组公布后,Xiao等通过基因组扫 描的方法对鸡卩-防御素基因组鉴定得出鸡全基因组共编码13种p-防御素，被命名为 Gallinacin-1?Gallinacin-13。随后Lynn等(2007) 乂发现/奶防御索14。随着对禽P-防御索 研究的进展，鸡P-防御素被重新整理命名为AvBD-1?AvBD-14。 14种鸡p-防御素基因结构紧凑，大小只有86kb，位于第三号染色体的q3.5?q3.7上。鸡 P-防御素基因含有4个外显子，但是AvBD12最后W个外品子融合在一起，只有3个外显子， 编码信号肽，前片段和成熟肽三部分(van Dijketal, 2008)。鸡p-防御素成熟肽富含精氨酸， 带正电，分子内有6个半胱氨酸残基，分别在分子内形成1-5、2-4、3-6三对二硫键，构成稳 定的反相平行的3股p-什层结构C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C—C。鸡P-防 御素的成熟肽都具行两亲性，冇疏水的内部空间和带行电荷的侧链，分子内的高度保守二 硫键控制肽的构象变化。二硫键对防御素的抗菌活性无直接作用，但对防御素的功能，如抗 蛋凸水解和抗趋化作用有秉要意义(Wu et al, 2003; Kliiver et al, 2005; Selsted et al，2005)。可通 过复杂的机制抑制微生物生长或杀死微生物，如防御素抑尚的“膜孔模型”(Lehreretal，1989; Hancock, 1997; Hancock et al, 1999; Oren et al, 1998; Tang et al, 1999; Ganz, 2003; Wang et al， 2003)o 鸡P-防御素是禽类先天異有的内源性免疫防御系统的熏要组成部分，異有免疫调节作用, 且有广谱抗荫活性，可抑制或者杀死多种革兰氏阳性和明性蘭、真蔺。人工合成的鸡AvBD-9 在浓度为3.7 pmol/L时对革兰氏阴性菌空肠弯曲菌显现出极强的抗菌活性，在浓度为1.9? 3.7pnol/L和1.9 pmol/L时分别对革兰氏阳性傳产气荚膜梭菌、金黄色葡细球菌和酵母內色念 珠菌、啤泗酵叩有抑菌能力。但是AvBD-9对于鼠伤沙门氏菌没有杀菌作用030 gmol/L） （van Dijk et al, 2007）o人工合成的鸡AvBD-13有在高浓度（114（imol/L）吋，j对李斯特荫有杀苘 活性。当AvBD-13浓度达到14gmol/L和57,ol/L时分别对野生型和PhoP- （pho P葙因，转 录激活因子，调控鼠伤寒沙门氏菌毒力岛的表达）突变型鼠伤寒沙门氏菌杏杀菌作用（Higgs et al, 2005）。体外实验发现，AvBD-5对肠炎沙门氏菌有杀菌活性，且作川活性强于AvBD4