生物化学与分子生物学实验.pptVIP

一切器具均经高压灭菌，保证没有核酸和核 酸酶的污染 各试剂小份分装，-20 ℃保存，现用现取 酶的取用不离开冰浴 取液吸头、离心管均一次性使用，及时更换 操作注意事项 电泳结果有无目标条带出现，可判别+/-结果； 根据条带宽度和亮度，可直观判断扩增产量； 关于PCR假阴性、假阳性及非特异扩增问题。 实验结果 rat beta-nerve growth factor sequence 5’- 301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat 361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct 421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac 481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc 541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc -3’ 例如：PCR扩增NGF基因（大鼠） 预期扩增长度：220bp Perim 1: 5’-gat cgg cgt aca ggc aga ac-3’ （328-347） Perim 2: 3’-cgc ggg gtg aac gga gtc tc -5’ （529-548） NGF ←500bp ←200bp ←100bp 220bp → 电泳结果 空白 Mark PCR的反应特点 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 实验讨论 关于PCR假阴性、假阳性问题 每组PCR都要设立阴性对照(不加模板)，以检测有无污染 每组PCR都要设立阳性对照(加肯定的DNA)，以检测PCR的效率 通过重复实验、改善反应条件等排查假阴性 假阳性多是模板DNA污染的问题，查实后须更换所有试剂 引物特异性、纯度、Tm值 模板纯度、二级结构 退火温度（时间） 反应体系中的dNTP、Mg2+、Taq酶浓度 关于PCR非特异性扩增问题 长度在15-30bp，GC含量在45-55%之间 碱基分布表现出随机性，避免相同碱基连续排列 3’不能与引物内部互补，以免形成二级结构 两个引物各自的3’不能互补，以免形成自身扩增 引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非 目的DNA高度互补 引物设计 基因的分离、克隆、核苷酸序列分析 突变体和重组体的构建 基因表达调控研究及基因多态性的分析 遗传病、传染病的诊断和肿瘤机制的探索 刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子系统学 研究等 PCR的应用 PCR的主要原理是什么？ 电泳结果出现非目的片段的可能原因有哪些？ 思考题 实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题 实验十一 琼脂糖凝胶电泳 预 习 返回目录 返回目录 实验十一琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验目的 了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理，学会其具体的操作程序 对提取的DNA进行检测，掌握紫外电泳图谱的观察分析方法 实验原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。 恒温培养箱 实验仪器 水平电泳槽 琼脂糖凝胶电泳系统 稳压电源 台式离心机 紫外线透射仪 实验结果 1 2 3 1号：磷酸鉴定（蓝色） 2号：碱基鉴定（红棕色） 3号：核糖鉴定（蓝绿色） 思考题 在酵母破壁时为什么只能水煮沸了以后再放入装有酵母和10% NaCl的三角瓶？ 本实验中两次调pH值的目的分别是什么？ 返回目录 返回目录 实验九葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 实验目的 学习和掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖 含量的方法 熟悉酶法测定血液中葡萄糖糖浓度 的原理 掌握测定血糖的临床意义 实验原理 葡萄糖 ﹢ O2 H2O2 葡萄糖醛酸 ﹢