印迹技术.PPT

分子生物学基本技术 讲授内容 一、分子杂交与印记技术 二、PCR技术 三、基因文库 四、DNA测序技术 五、芯片技术 六、蛋白质相互作用研究 一、分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 二、聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 三、基 因 文 库 Gene Library  四、DNA序列测定分析 Nucleic Acid Sequence Analysis * 目 录 * * 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、基本原理 （一）印迹技术 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ 放射自显影照片 其他杂交技术： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 斑点杂交（dot blotting） 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。 反向斑点杂交（reverse dot blotting） 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。 * 原位分子杂交技术 原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术； 可用于基因及其表达产物的定位分析。 荧光原位杂交（FISH） DNA点阵 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本原理 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分 三、PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 四、PCR的主要用途 实时PCR技术原理 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因组DNA文库 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例