凝乳酶如何使牛奶凝块.DOC

PAGE PAGE 41 干酪若干生产问题详解 天津科技大学干酪科学与工程研究室 翻译自Cheese Problem Solved 1 凝乳问题 （1）凝乳酶如何使牛奶凝结？ 牛奶中的酪蛋白（占牛奶蛋白质的80%）以大的、多分子聚集体的胶束形式存在。酪蛋白胶束形状近似于酪蛋白的球状聚合体，构成聚合体的酪蛋白主要有：αs1、αs2 、β、及κ酪蛋白，酪蛋白与无机离子结合形成的胶束统称为胶体磷酸钙。整个胶束上不同种类的酪蛋白分布不均，特别是κ酪蛋白基本分布在胶束的表面，κ酪蛋白主要起着稳定胶束的作用，并且可以防止Ca2+存在是胶束和胶束聚集到一起。如果κ酪蛋白不存在，其他酪蛋白因为高度磷酸化作用会在Ca2+存在条件下彼此发生聚沉。 Κ-酪蛋白被分成两个部分。残基1—105（约占分子大小的2/3）是疏水的,并且与其他酪蛋白结合，而κ-酪蛋白的C末端区（残基106—169）是亲水的（这些残基通常含有复杂的糖类集团，而这些糖基又与苏氨酸发生过酯化反应），正是κ-酪蛋白的亲水部分深入环境之中稳定着胶束(图1)。 图1 κ-酪蛋白 酶作用条件下牛乳的凝聚包含两个过程，首先是被称作“凝乳酶”的酶作用在κ酪蛋白Phe105—Met106键上，或其临近键，κ-酪蛋白有限的水解改变了酪蛋白胶束，然后Ca2+存在条件下就诱导了状态发生变化的胶束聚沉。 Κ-酪蛋白是唯一中在凝乳酶凝聚牛乳时发生了水解的酪蛋白。Κ酪蛋白水解后产生κ-酪蛋白侧枝（κ酪蛋白片段1—105）和大分子肽（糖巨肽和酪蛋白大分子肽）。大分子肽溶入水相，而κ酪蛋白侧枝仍然位于胶束中心。这样大分子肽（含有30%κ-酪蛋白，或者4%—5%的酪蛋白）就损失掉了。这是凝乳酶凝固牛乳过程中不可避免的结果，但是这种损失会影响到奶酪产品的产量。凝乳酶制剂水解κ酪蛋白被称作凝乳酶凝乳的第一阶段（图2）。 从胶束中除去的大分子肽降低了胶束的表面电位，表面电位从-20mv减少到-10mv，大分子肽的除去的同时也除去了空间位阻的稳定层。当κ酪蛋白的80%被水解后，胶束的胶稳性被大量破坏，在Ca2+存在时18℃以上就可以凝结成块，这被称作凝乳酶凝乳的第二阶段。 图2 凝乳酶凝结反应的第一和第二阶段 （2）为何酪蛋白的苯丙氨酸—蛋氨酸键对凝乳酶很敏感？ 这个κ-酪蛋白的Phe105—Met106很多时候对比κ-酪蛋白其他键对凝乳酶更敏感。但是不一定存在Phe-Met残基，人类、猪、及啮齿类动物的κ-酪蛋白在106位点是异亮氨酸和亮氨酸，有趣的是，栗疫病菌的蛋白酶切割临位上的键（丝氨酸104-苯丙氨酸105）。通过研究凝乳酶作用于和κ-酪蛋白区具有相同氨基酸序列的短肽链，我们研究了Phe-Met键的重要性。凝乳酶水解的最短肽链是κ-酪蛋白片段上的104-108（即丝氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸）；将这段肽向外延伸朝着κ-酪蛋白的C-或N-末端，这是这个多肽就对凝乳酶变得敏感了。Κ-酪蛋白的98-111片段和完整的κ-酪蛋白、具有某些重要氨基酸残基肽链一样易水解（例如,丝氨酸104，亮氨酸103，缬氨酸107，异亮氨酸108）。Phe-Met键是κ-酪蛋白分子的二级结构中一个非常外露的部分，这个二级结构由位于两个β转角的β链构成，方便了像凝乳酶这样的天冬酰胺蛋白酶进入活性位点开口。残基98-111区域的κ-酪蛋白构象表现分子的这部分非常容易受到凝乳酶的作用。 当有85%的κ-酪蛋白被水解了，胶束开始聚集逐步形成胶状网络。加入凝乳酶后，凝胶粘度快速地升高，接着有轻微的初始粘度下降（这是由于凝乳酶作用后，大分子肽从胶束中流失，胶束中水的大量减少，胶束大小的小量减少使得胶束的有效体积减少）（图1）。当κ-酪蛋白的水解程度低时，凝聚发生在较高温度下，然而，牛乳凝乳温度通常设定在30℃。pH的降低和Ca2+浓度的升高也会加速凝乳。 虽然不完全清楚凝乳的实际过程，但是以下几点比较明确。 Ca2+是必要的，而且Ca2+结合酪蛋白的能力在凝乳过程中不发生改变。 胶体磷酸钙也是必要的；在CCP中20%的减少量会抑制凝乳。 疏水作用很重要，（凝乳酶凝固易溶于尿素） 静电相互作用可能是重要的，因为适度的高离子强度不利于凝乳酶凝乳。 pH在凝乳的第二个阶段几乎不起作用（但是在一个阶段起重要作用）。 凝乳对温度非常敏感，低于18℃不会凝乳。 图1：牛奶凝乳酶凝乳示意图：（a）酪蛋白胶束中的κ-酪蛋白层完整，受到凝乳酶C的作用；（b）胶束中的κ-酪蛋白部分外露；（c）凝乳过程中胶束中的κ-酪蛋白大量外露；（d）凝乳过程中大分子肽的释放（环形）和相对密度的变化（方块状）。 （3）如何证明凝乳酶凝乳分为两个阶段？ 凝乳酶凝乳过程有两个明显的阶段：酶在κ-酪蛋白Phe105-Met106将其裂解，凝乳酶作用的胶束形成凝胶，凝乳酶凝乳不同阶