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质粒的特点 细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子； 质粒是基因工程中最常用的运载体； 存在于许多细菌及酵母菌等生物中； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。 质粒的存在对宿主细胞无影响； 分为两种： 1. 溶菌周期： 二、噬菌体的生活周期 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。 烈性噬菌体（virulent phage) 2. 溶源周期： 感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。 温和噬菌体（temperate phage) 原噬菌体（prophage)： 噬菌体载体 ◎ 单链噬菌体载体——M13 ◎ 双链噬菌体载体——λ噬菌体 ◎ cosmid克隆载体 三、单链噬菌体载体 M13、f1、fd 噬菌体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13 噬菌体 （2）复制型（RF）是双链环状DNA为中间媒介。 1. 单链DNA噬菌体的特点 （1）+DNA。（ssDNA） M13噬菌体感染雄性大肠杆菌后，M13的“+”链DNA进入细胞内，以此为模板复制互补的“-”链DNA，由此产生的双链M13DNA称为复制型DNA（RF-DNA）。 RF-DNA一般按环状双链DNA进行复制，同时以“+”链DNA为信息转译出一系列与包装相关的蛋白质。 当细胞内的RF-DNA达到近200个拷贝时，则RF-DNA中的“+”链DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合，阻断“-”链DNA的复制合成。其结果，细胞内只能以“-”链为模板不断复制合成新得“+”链DNA。而新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并且不断挤出宿主细胞。 +DNA -DNA mRNA M13外壳蛋白 组装成子代M13 +DNA 注入大肠杆菌 复制 转录 翻译 +DNA 指导合成 +DNA 200个 RF DNA 每个细胞可以放出约1000个M13颗粒！ （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。 （4）不存在包装限制(噬菌体颗粒大小，是受DNA多寡制约) （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。 2. M13 噬菌体 RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。 成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。 M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。 但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。 6407 bp，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。 （2）DNA长度 （3）DNA提纯 （1）寄主 （4）M13的生活周期 虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4） M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA +DNA合成－DNA，形成RF dsDNA －DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白 组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞 M13的包装过程： RF dsDNA指导合成的+DNA M13基因V编码单链DNA结合蛋白 DNA-蛋白质复合物 转移到寄主的细胞膜 M13外壳蛋白 基因V蛋白脱落 +DNA 溢出细胞膜 包装 （5）没有包装限制 3. M13载体的构建： M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。 （1）克隆区域的选定 ① 基因间隔区（intergenic region, IG区） IG区内只有一个 BsuI 切点。 其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。 ② 酶切位点 M13 J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。 利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。 （2）加入酶切位点 ① 在IG区内加入单一内切酶位点 第一个M13载体：M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各种长度的线性片断 （其中应有只在IG上切开的线性全长M13） E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’） 连接 M13mp1 JM101宿主 只有在IG区插入lacZ’才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑 ① 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降 ② 实际克隆能力小于1500bp。 虽无包装限制，并非无限包装！ 5. M13载体的缺点 M13 克隆载体的应用 主要应用于克隆和分离单链外源DNA片断 二 双链噬菌体载体—?载体 （1）长