酶切、连等接与转化.pptVIP

限制性酶切、连接与转化;一、酶切1、核酸酶的分类： 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；  核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。 ;？ 如果内切酶可以切掉入侵的病毒DNA，为什么它们不会破坏宿主细胞自身的DNA ;限制修饰系统 简称 R/M系统 restriction modification;2、 限制性酶切的原理： 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。;;限制性酶切序列;识别序列;4. 影响核酸限制性内切酶活性的因素;5、限制性内切酶的星号活性;二、DNA连接酶与DNA分子的体外连接 ;T4连接酶作用分三步： T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。 (2) 酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的 DNA上，使DNA腺苷化。 (3) 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.; 影响连接效率的因素： A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值（载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：3～1：10） E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。;三、转化;DNA 克隆的简单流程 ;谢谢