基于cia大鼠两种抗原短肽特异性自身免疫反应的实验研究-生物学;生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 研究背景： 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种典型的由抗原驱动和T细胞介导 的慢性、进行性的自身免疫性疾病。其特征是外周循环中可检出大量的针对自身抗 原成分的自身抗体和抗原特异性T、B淋巴细胞。该病病因复杂，发病机制尚不明确。 目前尚缺乏有效的早期诊断指标。该病病变主要累及外周小关节，最终可能会导致 进行性关节破坏、畸形，甚至功能丧失。胶原诱导性关节炎(collagen．induced arthritis， CIA)模型是通过用II型胶原(type II coUagen,C II)免疫鼠类诱导的多关节炎症。 由于其引起的症状和关节病理与RA有诸多相似之处而被认为是人类RA的独特动物 模型，被较广泛地用于RA机制的研究。 目的： 建立新的血清学实验诊断体系，寻找新的自身抗体标志物，观察环瓜氨酸肽 (ccP)及Ⅱ型胶原短肽(C 11260．272)作为特异性抗原刺激物对胶原诱导型关节炎 (CIA)大鼠淋巴细胞激活的影响，以及经上述特异性抗原刺激后细胞上清中ⅢN吖 等细胞因子的分泌情况，探讨上述抗原在CIA大鼠成模过程中的作用，并为进一步 了解其在RA中的作用机制提供理论和实验依据。 方法： 建立CIA大鼠模型，采用肽酰精氨酸脱亚氨基酶(PAD)对牛Ⅱ型胶原(bC II) 进行瓜氨酸化(citruUination)，同时选择CⅡ短肽(CIl260．272)和环瓜氨酸肽(CCP) 及PAD酶为包被抗原，建立检测其血清中自身抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)。 分别在建模1周、2周 8周后分离、培养大鼠脾淋巴细胞，采用CCK-8法检测CCP 及II型胶原短肽(C11260．272)对淋巴细胞增殖反应的影响，并用ELISA法检测经上 述特异性抗原刺激后细胞上清中IFN．Y、IL-4、IL．17等细胞因子的分泌情况，同时 对建模时间、细胞增殖指数及其他血清学指标、关节炎症指数等的关系进行相关分 析。 结果： l、造模后第10 d，模型组大鼠即出现肿胀高峰，随着时间的延长，关节炎症 指数继续升高，至16d时出现第2个关节炎症高峰。同时模型组大鼠在首次免疫第 2 W即出现滑膜炎症和血管翳高峰，尽管到后期有所减退，至实验结束时(8 W后) 仍可观察到较弱的关节滑膜炎症和血管翳形成。病理学观察结果显示，模型组大鼠 关节囊滑膜组织呈乳头状突起增生，滑膜层变厚，排列紊乱，滑膜内可见淋巴细胞、 浆细胞，以及巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润，血管翳明显增多。与0周组 摘要相比，模型组大鼠寡聚基质蛋白(COⅧ)表达水平均有不同程度的升高，有显著 摘要 相比，模型组大鼠寡聚基质蛋白(COⅧ)表达水平均有不同程度的升高，有显著 统计学差异(尸均O．01)。相关性分析表明CIA模型组大鼠血清中COMP表达水 平与关节炎症指数(P0．05)呈显著正相关。 2、血清学指标检测结果显示，模型组大鼠中，抗PAD酶抗体、抗CCP抗体、 抗CⅡ短肽抗体及抗CⅡ抗体、抗Cit-CⅡ抗体均出现不同程度的升高，其中尤以抗 CII短肽抗体与抗CCP抗体升高更为明显。相关性分析结果表明，前者与关节炎症、 滑膜炎、血管翳显著相关(P0．05帮O．01)。同时，抗PAD酶抗体与抗CCP抗体、 抗CⅡ短肽抗体及抗Cit．C II抗体水平(尸均0．01)，抗CCP抗体与抗C II短肽抗体、 抗CⅡ及抗Cit．C II抗体(PO．05或P0．01)也存在显著相关关系。 3、增殖检测结果显示CCP抗原特异性T细胞(CCP．AST)细胞及CⅡ短肽抗原 特异的T细胞(CⅡ．AST)在首次免疫2~3周即出现明显的增殖反应，显著高于实验 对照(FLⅨ肽刺激组)和细胞对照组(0周CCP刺激组)的增殖水平(尸妯．01或尸 0．05)。相关分析结果表明基于CCP刺激的特异性T细胞增殖刺激指数与CIA病程 (建模时间)、关节炎症指数及抗CCP抗体、抗CⅡ短肽抗体产生水平显著相关(P 0．01或P0．05)，但未见CⅡ短肽抗原特异性T细胞增殖反应与抗CⅡ短肽抗体有 相关关系(PO．05)。 4、细胞因子检测结果显示，与对照组相比，早期模型组大鼠血清,IFN-v、IL．17 的分泌水平显著升高(P均O．01)，而IL-4一直保持较低水平。4周开始，IFN-Y水 平开始显著下降(尸均O．01)。在两种抗原肽刺激后的细胞培养上清中，WN-q,和 几．17的检出水平与0周对照组比较，均有显著提高(P均0．01)，与血清中检测结 果不同的是，几．4浓度几乎一直保持较高水平。相关性分析结果表明，经ccP,U激 后RSMC分泌产生的I】附吖、几．17水平与CCP．AST细胞增殖呈显著正相关性(尸均 0．01)，并与CⅡ短肽抗原特异性T细胞增殖亦互为相关关系；