枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育讲义.doc

枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育 在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理微生物，使基因发生突变，可能导致微生物提高或者减低合成某一物质的能力。物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等。诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。用诱变剂处理微生物，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，处于该期的细菌对诱变剂最敏感。 必须选择合适的剂量进行诱变处理，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与3个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源（紫外灯）的功率、处理的时间。前2个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。处理不同微生物的最适剂量是不同的，须经预备实验确定。 本综合实验利用紫外线诱变枯草芽孢杆菌悬浮的菌体，分析不同参数下的紫外线致死率及诱变率，筛选产量提高的产淀粉酶菌株。学习物理因素诱变育种的方法，并掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，最终从诱变菌株中筛选出淀粉酶活力较高的菌株。 实验一 紫外诱变及高产菌株的初筛 （一）实验目的 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 （二）实验材料与用品 菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机。 （三）实验内容与方法 （1）菌悬液的制备 取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108个。 （2）平板制作 将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理 将紫外线灯开关打开预热约 20分钟。 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。 将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。 （4）稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可 按估计的存活率进行稀释）。 （5）涂平板取 10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3只，每只平板加稀释菌液0.1 ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。 （6）培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养 48 小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 （7）计数将培养 48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。 （8）观察诱变效应 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。 （四）实验作业 记录实验数据，分析实验结果并进行讨论，撰写实验报告。 实验二 高产菌株的鉴定 （一）实验目的 1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法； 2．从初筛所获得的诱变菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。 （二）实验原理 淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。 淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 （三）实验用品 1．粗酶液 实验一保存的HC比值大的菌落进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。 2．试剂 碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中； 比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中； 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，