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Y【|海交通大学博士后 Y 【|海交通大学博士后 站T作报告 基因治疗用腺病毒栽体的耐f究 第一部分腺病毒外壳纤维改造技术平台的建立 中 文摘要 【研究背景】：腺病毒载体具有较高的感染效率，一直在基因治疗中扮演重 要角色，是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。截止2006 年1月，全球已实施的1 145项基因治疗临床试验方案中，使用腺病毒作为载体 的有287项，占25％，已超过了逆转录病毒载体(276项，占24％)，其中选用 最多的是2型和5型腺病毒载体。然而腺病毒载体介导基因转导仍面临两大难题： 一是对某些细胞的转染效率较低。由于某些靶细胞表面与腺病毒特异结合的受体 表达不足或缺乏，导致腺病毒载体不能将目的基因有效地导入这些细胞(例如： 肿瘤细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、 外周血细胞、造血干细胞、树突状细胞 等)；二是缺乏靶向性。由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感 染其他正常组织，体内应用时存在明始的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝 脏内聚集，产生毒副作用。所以迫切需要改变其天然嗜性，构建针对特定组织、 细胞的靶向性腺病毒。 【目的】：本研究的目的是建立一种方便、快捷的腺病毒外壳纤维改造的技术平 台。 【方法】：在对腺病毒基因组顺序进行分析的基础上，我们采用多步亚克隆方法， 先用限制性内切酶逐步消化并分离含腺病毒Fiber基因的DNA片段，采用 QuikChange。Site Directed MutagenesiS Kjt(Stratagene)试剂盒，通过定点 诱变的方法在Fiber头部HI—loop区插入单一限制性内切酶Swa l识别位点；再 逆向将改造后的DNA片段逐层放同腺病毒的基因组中。具体如r：首先从腺病毒 Ad5的骨架质粒pBHGlOX一△E1，E3Cre的Clal和PacI问切出一6．6kb片段，此 片段包含了腺病毒Ad5完整的Fiber基因，将其插入到pCEP4’的C1aI和PacI 卜海交通大学博上后出站工作报告 卜海交通大学博上后出站工作报告 基圳治疗川腺病毒载体的研究 之间，产生质粒pCEP4 7—6．6kb Fiber。然后质粒pCEP4’一6．6kb Fiber经KpnI 酶切，得到一约2．8kb片段，此片段含有腺病毒Ad5完整的Fiber基因，将其 插入到pCI的KpnI之间，产生质粒pCI一2．8kb Fiber。以pCI一2．8kb Fiber为 模板，采用定点诱变的方法在纤维圆头的HI—loop区插入单。SwaI限制性内切 酶位点，产生质粒pCI一2．8kb mFiber。最后逆上述步骤将突变的Fiber逐层放 回，产生质粒pCEP4’一6．6kb mFiber和pBHOlox／XEl，3Cre—SwaI。将穿梭质 粒pDC315一EGFP和改造后的腺病毒骨架质粒pBHOloxAEl，3 ere—SwaI共转染 293包装细胞，通过在293细胞内重组产生Fiber突变的腺病毒Ad—SwaI。 【结果】：所有的构建均完成并经酶切鉴定及测序证实。Ad—SwaI(在纤维圆头 的ItI loop区插入了单一SwaI限制性内切酶位点)已在293细胞内包装成功并 经PCR检测证实。 【结论】：成功建立了-IO方便、快捷的腺病毒外壳纤维改造的技术平台，只需 一步简单的体外连接和转化即可完成腺病毒外壳纤维的改造。 【关键词】腺病毒：靶向性腺病毒；基因治疗 上海交通大学博上后出站工作报告 上海交通大学博上后出站工作报告 皋园治疗用腺病毒载体的研究 Abstract SECTION I： Construction of Targeting Adenovirus Vector Technical Flat 毋ackground】：Adenovirus(Ad)vectors have been expected to play a prominent ro]e in gene therapy because of their extremelY high transduetion efficiency．However，there are two hurdles confronting Ad vector—mediated gene transfer．One is their inefficient transduction to target cells lacking sufficient expression of the coxsackievirus and adenovirus receptor(CAR)．