基因重组酿酒酵母psma疫苗构建的初步研究-外科学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 恭困重组酿酒酵母疫茁是一j}孛新型豹“免疫裁激复合物疫莛”，冀既能{乍 为表达体系完成抗原的加载，又能发挥出佐剂作用诱导机体产生有效的抗原特 异淫懿缀照毒羧T漤憨缓藏(cytotoxic lymphocyte，CTL)兔疫疲答。本礤究拟 应用具有高度前列腺肿瘤特异性的前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSi)俸兔黯载貌瓣，逶：；建基函熏缀技术暮并究分辑入PSMA 基因片段在酿淄酵母INVScl中的诱导波达情况，并获得足够数量的基因重组 PSMA酿酒酵母，籍诧{乍为疫苗为进一步探讨其在体内拂的抗前粥腺胂瘸效应及 评估瘤菌的安全性打下基础。 1．材料 双剡性内键酶8ailIH{、XhoI和T4 DNA逐援酶赡囊NEB：DNA片段胶回收 试剂懿购自Qiagen；酿酒酵母穿梭诱鼯表达质粒pYES2／NT、酿酒酵母菌株 INVScl发酵母感受态稍蚤移转讫试剂鑫S。e。EasycompTM transformation Kit 购自Invitrogen；酵蹲培养基、半乳糖、PSMF、玻璃珠(0．4～0．6m m)购自 Sigma公司；鬣挠人PSMA荸究隆抗诲Y／PSMAl黉；l套Biodesign；鬣撬Xpress 表位单克隆抗体购自Invitrogen：含肖PSMA cDNA全序列的黧组质粒 pcDNA3．O-PSMA及大肠杆菌受体菌DHs。由本校基础医学院检验医学系提供；篡 余试翔笼Sigma或Invitrogen产品。 2．方法 2。1 pYES2／Nf一珞凇攫缀酿潘酵母诱浮表达震粒黪稳建； 用BamH I及Xho I两种限制性内切酶对质粒pcDNA3．0-PSMA进行双酶切， 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，闻收2．2Kb的hPSMA cDNA片段，并将PSMA cDNA 片段甄克隆到酿酒酵母穿梭诱导表达蕨粒pYES2／NT中相应的多克隆经点，连 接产物经酶切鉴定。 2。2羧涯酵避豹pYES2／NT—PS6aA痰歉转纯及骝牲转化子麓筛选： 按Invitrogen S．C．Easycomp“transformation试剂盒说明书制备感受态 酿滔酵母，女E入l’3ug重蕴pYES2／NT-PS＆IA避章亍转纯，藤毽麓薅逸爨羯淫转纯 子。 2．3 pYES2／NT-PSMA在酿酒酵母中的诱导表遮及Western印迹分拆： 王 (1)重组pYES2／NT—PSMA的诱导表达：将阳性克隆单菌落扩增后接种于含2％半乳糖的Sc—Lira培养液，分别于诱 (1)重组pYES2／NT—PSMA的诱导表达： 将阳性克隆单菌落扩增后接种于含2％半乳糖的Sc—Lira培养液，分别于诱 导表达O、4、9、14、19 h后收集酵母菌，酵母沉淀进行玻璃珠破碎抽提蛋白。 (2)表达产物的Western印迹分析： 取以上各时间点的样品(蛋白总量为40ug)进行SDS PAGE电泳后，电转 印到硝酸纤维素膜(NC)上，电压IOOV，电转移60min，分别应用鼠抗人PSMA 单克隆抗体Y／PSMAl和鼠抗Xpress表位单克隆抗体进行Western印迹分析。 3．结果： 3．1 pYES2／NT—PSMA重组酿酒酵母诱导表达质粒的构建： BamH I和Xho I酶切鉴定重组质粒pYES2／NT—PSMA，酶切结果显示PSMA cDNA片段(2．2Kb)己克隆入酿酒酵母诱导表达质粒pYES2／NT。 3．2酿酒酵母的pYES2／NT—PSMA质粒转化及阳性转化子的筛选： 感受态酿酒酵母菌转化重组质粒后，经尿嘧啶筛选出阳性转化子，平均每 个培养板可获得200’500个阳性转化子。 3．3重组pYES2／NT—PSMA在酿酒酵母INVScl中的诱导表达和Western印迹分 析： 携带有重组质粒pYES2／NT—PSMA的宿主菌INVScl进行半乳糖诱导表达，菌 体裂解物分别应用鼠抗人PSMA单克隆抗体Y／PSMAl和鼠抗Xpress表位单克隆 抗体进行Western印迹分析。结果显示，重组工程菌可表达IOOKD和85KD两 种rhPSMA，且在半乳糖诱导表达约9小时后达到表达高峰。 4．结论： PSMA基因片段能够在酿酒酵母中诱导表达并完成翻译后糖基化修饰，这 为进一步探讨基因重组酿酒酵母PSMA疫苗在体内外的抗前列腺肿瘤效应及评 估瘤苗的安全性打下了良好的基础。 II AbstractGene Abstract Gene recombinant yeast vaccine Was a new type of immunostimulating complex vaccine，which was able to not only express exogenous antigen bu