基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

灌793121声 灌793121 声 明 本人声明所至交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其她教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所馓的任何贡 献均已在论文中怍了明确的说明并表示谢意。 奉学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有．特此声明。 申请人；名；，霞 指导教师：犀霖 |-措工矗^届扦—rjLI童J_‘t■u—^岛|t曲研兜(中支l墨·)基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究 |-措工矗^届扦—rjLI童J_‘t■u—^岛|t曲研兜(中支l墨·) 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究 研究生：李红霞 导师：余蓉教授 四川大学华西药学院生物制药教研室 摘要 本研究在前期研究的基础上，进一步对基因工程大肠杆菌 (RRhPI／pQE40E．coli M15)生产(His)6一Arg—Arg人胰岛素原(RRhPI) 的发酵工艺及其下游纯化复性工艺进行了全面优化，初步建立了一套高 效表达、分离纯化简便、回收率好的工艺，并进一步放大至发酵罐水平， 为工业生产提供了可行性研究。 采用正交法对培养基组成、培养条件、诱导条件进行优化后，摇瓶培 养可收获湿菌体434-0．179／Ign=3)，包涵体约14--+0．52 g／L(n--3)，表达水 平约为30％，超过现有文献报道水平，而发酵时间较先前工艺缩短18— 30小时。将摇瓶优化出的培养基、培养条件放大至发酵罐进行单批发酵， 每升培养基可收获E．coli51．．82克(湿重)，包涵体16．23克(湿重)．超过 现有文献报道水平。比较了超声破碎细胞和溶菌酶／超声破碎细胞两种方 法，并结合对包含体洗涤方法的优化，得到纯度较高的包涵体。对包涵体 的纯化复性工艺进行多方面综合考察比较，得到简便高效的纯化复性工艺 ——二次复性法，纯化的表达产物收率达85％以上；并进一步研究利用 DEAE一琼脂糖快流速阴离子交换柱作柱上复性和纯化的工艺，目前尚未 见有关文献报道。经酶切纯化后每升培养基可得纯化的人胰岛素约 79mg，超过现有文献报道水平。采用纯化后的重组人胰岛素产品经 SDS．PAGE检测为单带，且与人胰岛素标准品位置相同。HPLC、氮基酸 ．1． I_zl^斛-lI^PtI^^岛¨_￡(十l_1)组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。 I_zl^斛-lI^PtI^^岛¨_￡(十l_1) 组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。 关键词：重组人胰岛素大肠杆菌发酵纯化复性 I目zl^n抒ll_l，-II^l_●曲_￡fl^-I)Studies I目zl^n抒ll_l，-II^l_●曲_￡fl^-I) Studies on the Comprehensive Optimization of Expression And Purification of Recombinant Human Insulin Postgraduate：Li Hongxia Tutor：Prof．Yu Rong Department of Biopharmaceutics West China School of Pharmacy Sichuan University Abstract This_study comprehensive optimize the fermentation of reconbinant Escherichia．coli expressing(Hi06-Arg—Arg—human·pminsulin(RRhPI)，and down．ream process of recombinant human insulin was investigated．A defined culture medium，fermentation conditions and induction strategy were developed by means of onhogonal design．It allowed gTovnh of the recombinant￡．coil M15 up to 43-4-0．179／U wet wei曲qL(n=3)in shake·flasks．which produced 14±0．52 gm wet inclusion bodies：The expression level accounted for about 30％of total bacteria proteins．The recombinant E