互花米草抗氧化相关基因的克隆及功能鉴定-海洋生物学专业论文.docxVIP

烟台大学硕士学位论文 烟台大学硕士学位论文 PAGE 1 PAGE 1 摘要 互花米草是一种高度耐盐的盐生植物，可能存在其独特的抗逆机制，解除活 性氧毒害的机制也可能异于其他植物。因此，从盐生植物互花米草中克隆活性氧 清除酶类基因并分析其功能，可能有助于理解植物中氧化胁迫的耐受机制。 22本实验较系统地研究了高浓度NaCl处理下，互花米草叶片中清除 Ο? 和H2O2 的各种酶(SOD、CAT、APX)的活性，并结合其它生理指标阐明它们在互花米草 耐盐性中的作用，旨在了解互花米草的耐盐性与 Ο? 和H2O2清除系统的关系，进一 步完善盐生植物的耐盐与抗氧化之间的关系机理，在此基础上我们克隆了互花米 草APX1、APX11、CAT1基因，并分析了其在高盐、重金属、ABA、干旱、低温及 高温胁迫引起的氧化胁迫中的作用，结果如下： 2 2 （1）胁迫处理对互花米草叶片MDA（丙二醛)含量和质膜透性的影响 分别用600 mmol/L NaCl和500 μmol/L Cd2+处理互花米草幼苗，叶片中 MDA 含量和质膜透性分别较对照组有升高，说明高盐和重金属Cd2+对互花米草幼苗的 胁迫已经造成膜系统的损伤,且重金属Cd2+对互花米草膜系统的损伤大于高盐对 互花米草膜系统的损伤。 （2）胁迫处理对互花米草叶片脯氨酸含量和可溶性糖含量的影响 分别用600 mmol/L NaCl和500 μmol/L Cd2+处理互花米草幼苗，叶片中脯氨酸 含量较对照组有极显著升高（P＜0.01），而可溶性糖的含量变化情况分别为极显 著持续上升（P＜0.01）和先剧烈升高后缓慢下降。这意味着脯氨酸和可溶性糖可 能是调节互花米草受到高盐胁迫引起的渗透胁迫的主要渗透调节剂，而脯氨酸是 Cd2+胁迫引起的渗透胁迫的主要渗透调节剂。 2（3）胁迫处理对互花米草叶片 Ο? 含量和H2O2含量的影响 2 2在600 mmol/L NaCl和500 μmol/L Cd2+处理下，互花米草体内 Ο? 含量有极显著 升高（P＜0.01），H2O2含量有显著升高（P＜0.05）。这说明互花米草在受到高盐 和重金属胁迫引起的氧化胁迫时，产生大量ROS。 2 （4）胁迫处理对互花米草叶片抗氧化酶类活性的影响 2互花米草叶片中的SOD、CAT、APX是清除 Ο? 和H2O2的最基本的酶类，盐处 2 2理后其活性都有不同程度的改变。还原 Ο? 为H2O2的SOD活性显著高于对照组，且 随处理时间的延长呈先上升后下降趋势；清除H2O2的酶CAT、APX的活性则极显 著高于对照(P＜0.01)，盐处理酶的变化趋势也为先上升后下降，而Cd处理酶的变 化趋势为持续显著上升。同时非变性的聚丙烯凝胶电泳结果显示，虽然同工酶的 不同亚型会随处理时间略有变化，但是总体活性的变化和测得的酶活性变化趋势 吻合。这些结果意味着互花米草有着很强的抵抗盐胁迫和重金属胁迫引起的氧化 胁迫的能力。 2 （5）互花米草SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1基因克隆及序列分析 利用简并PCR和5’、3’RACE克隆得到了互花米草抗氧化基因APX和CAT，分 别命名为SaAPX1, SaAPX11和SaCAT1，均为胞质型蛋白。SaAPX1, SaAPX11序列非 常相似，只在C末端有少量核苷酸的差别。 （6）互花米草SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1基因的表达谱分析 分别用20% PEG, 100 μmol/L ABA, 低温，高温处理互花米草幼苗，分别对其 叶片和根进行目的基因表达谱分析，结果显示，在逆境处理下SaAPX1、SaAPX11、 SaCAT1全部表现为升高，升高的形式略有不同。 （7）互花米草SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1基因功能研究 过表达SaAPX1、SaAPX11、SaCAT1的水稻及拟南芥纯合株系的筛选正在进行， 生理生化指标有待测定。 关键词：互花米草；活性氧清除系统；盐胁迫、重金属胁迫； APX，CAT基 因克隆；过表达水稻 Abstract 2Spartina alterniflora is a highly salt-tolerant halophyte, in which unique resilience mechanism may exist. The mechanism of releasing active oxygen species may also be different from that in other species. Therefore, cloning and functional analysis of genes regulating active oxygen scavenging enzyme in halophyte