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第十二章 分子生物学研究方法 SNP概述 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)：单个核苷酸的突变而引起的多态性。 单体型(Haplotype)：染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后代。 SNP分类： 基因编码区SNP(cSNP)： 同义cSNP：SNP导致的编码序列改变并不影响蛋白质的氨基酸序列，突变碱基和未突变碱基含义相同。 非同义cSNP：碱基改变使蛋白质序列发生变化，从而影响蛋白质的功能。常是生物性状发生改变的直接原因。 基因调控区SNP(pSNP)：影响基因表达量的多少。 基因间随机非编码区(rSNP)： cSNP、pSNP在功能和疾病发生、发展方面具有更重要的意义。 SNP检测技术 基因芯片、Taqman技术、分子信标、焦磷酸测序。 Taqman技术原理： 探针设计上，利用荧光共振能量转换(FRET)技术，探针5和3端分别用特殊的染料标记，称为供体-受体染料对或引爆-猝灭染料对。 正常情况下，由于探针5端荧光基团和3端猝灭基团紧邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被猝灭，只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。 Taqman技术的基本原理是利用Taq酶的5核酸外切酶活性，PCR反应中除了两个传统的PCR引物P1、P2外，还有第三个引物P3(等位特异性Taqman探针)，含有待检测的SNP位点，特异结合在P1结合位点的下游。P3探针的5端和3端分别标有荧光基团和猝灭基团，因P3的3端被猝灭基团封阻而不能以自身为引物进行扩增。 PCR反应中，Taq酶以P1为引物合成新的DNA链，随着反应的进行，Taq酶接触到P3并激发其5→3外切酶活性，使P3从5端开始降解，最后DNA链得以延伸，而P3探针上的荧光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上，荧光基团释放而发出荧光信号。 焦磷酸测序法： 核心：由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。 四种酶：DNA聚合酶(DNA poly merase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、双磷酸酶(apyrase)。 底物：5’-磷酰硫酸(adenosine 5’-phosphosulfate, APS)、荧光素(luciferin)。 每轮测序反应中，只加入一种dNTP，如果该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。 第一步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(DNA Polymerase、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶)和底物混合物(5’-磷酰硫酸APS和荧光素Luciferin)。 第二步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。 第三步：在ATP硫酸化酶作用下，生成的PPi与APS结合形成ATP。在荧光素酶催化下，生成的ATP又与荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。 第四步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在双磷酸酶的作用下发生降解。 第五步：加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 SNP应用 人类基因单体型图的绘制。 SNP与疾病易感基因的相关性分析。 指导用药与药物设计。 cDNA差示分析法克隆基因——RDA 代表性差异分析(representational difference analysis, RDA)： RDA充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段。 因试验对象(Tester)和供试探针(Driver)在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群(representation)，保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应中两者物质的量比要求达到1:100或更高，经2-3次重复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能性。 使用Gateway?技术进行克隆和表达一切皆有可能 通过TOPO反应将目的基因PCR产物连接到Entry载体中。 LR反应可将目的片段从Entry载体重组到表达载体中。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2