靶向抗肿瘤蛋白iRGD-CDD的原核表达及生物活性鉴定.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１２）：１９ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 研究报告檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 靶向抗肿瘤蛋白ｉＲＧＤＣＤＤ的 原核表达及生物活性鉴定 王启帆　薛　莹　冯新为　张　革 （中山大学药学院微生物与生化药学实验室　广州　５１０００６） 摘要　目的：原核表达并纯化具有特异性成纤维细胞激活蛋白（ＦＡＰ）酶切位点的靶向抗肿瘤 α ＧＰＣＤＤｉＲＧＤ融合蛋白，利用ＦＡＰ 的酶切功能切除融合标签，检测其对ＦＡＰ 阳性肿瘤细胞株 α α 的毒性。方法：设计并合成ＧＰＣＤＤｉＲＧＤ基因，插入 ｐＧＥＸ４Ｔ３载体，构建重组表达质粒，转化 至ＢＬ２１大肠杆菌感受态细胞中，ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳＰＡＧＥ分析重组融合蛋白的表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测融合蛋白的表达，经ＧＳＴ亲和柱纯化融合蛋白后，通过体外细胞毒性试验（ＭＴＴ法）和细 胞凋亡实验评价该融合蛋白的靶向抗肿瘤活性。结果：成功构建重组原核表达质粒ｐＧＥＸＧＰ ＣＤＤｉＲＧＤ，可溶性表达相对分子量约为３６ｋＤａ的融合蛋白ＧＳＴＧＰＣＤＤｉＲＧＤ，纯化后蛋白纯度 约为９０％，经ＭＴＴ实验测定其对ＦＡＰ 阳性４Ｔ１细胞株的ＥＤ５０约为１８．５ｍｏｌ／Ｌ，流式细胞术检 α μ 测到其对ＦＡＰ 阳性４Ｔ１细胞株具有选择性毒性作用，早期凋亡比例达到约２８％。结论：原核表 α 达的重组融合蛋白ＧＰＣＤＤｉＲＧＤ对ＦＡＰ 阴性４Ｔ１细胞株未显示毒性，而对ＦＡＰ 阳性４Ｔ１细 α α 胞株具有显著的促凋亡作用，为进一步研究其在体内的靶向抗肿瘤活性提供了依据。 关键词　靶向抗肿瘤　融合蛋白　促凋亡　酶切效力 中图分类号　Ｑ７８６ 　　肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病，已成 段肿瘤靶向渗透环肽，其最初定位到在肿瘤内皮血管 为人类死亡的主要因素，化疗目前仍是治疗肿瘤的主 上特异性表达的 Ｖ３和 Ｖ５整合蛋白而深入到肿 αβ αβ 要方法，但是化疗药物会同时损伤正常组织而产生严 瘤组织，然后水解裂开产生 ＣＲＧＤＫ／Ｒ序列，裂开后其 重的副作用，影响治疗。研究发现肿瘤组织表面往往 丧失了大部分的整合蛋白捆绑力，但是增加了对ＮＲＰ１ 会特异性表达一些蛋白或者受体成为肿瘤组织的分子 （神经菌毛素）的吸引力，与神经菌毛素的粘合，引发肿 标志物［１］。靶向治疗药物特别是以肿瘤靶向多肽为向 瘤特异性组织渗透。另有设计将ｉＲＧＤ肽与Ｂｉｔ１（一个 ［４］ 导的药物能够选择性定位到表达这些分子标志物的肿 促细胞失巢凋亡的线粒体蛋白 ）Ｎ端的６２个氨基酸 瘤组织表面，介导细胞内吞作用，进而产生抗肿瘤效应 组成的细胞死亡区域（ＣＤＤ）相偶联并原核表达该融合 ［５］ 而抑制肿瘤细胞生长或预防转移，同时减少对