一种检测儿茶酚-o-甲基化转移酶三荧光探针的设计合成及其生物应用-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

目 目 录 一、摘要 2 (一)中文摘要 - 一1 (二)英文摘要 2 二、正文 5 (一)前言(一)且U吾 55 第一部分方法评估 (二)材料和方法 ．8 1．材料 ．．8 2．仪器 9 3．方法 ．．9 3．1 S-COMT蛋白的表达与纯化 。9 3．2 甲基化产物的合成 9 3．3液相分析 ．．11 3．4 COMT反应检测 11 3．5最适pH条件检测 11 3．6 COMT最低检测下限 11 3．7酶动力学测定 ．12 3．8化学抑制试验 ．12 3．9 蛋白量与活性相关性试验 ．13 3．10细胞毒性试验 13 3．11细胞成像 ．13 万方数据 3．12分子对接模型 3．12分子对接模型 14 3．13 高通量初筛抑制剂 14 3．13 高通量抑制剂筛选 14 (三)结果 。14 1．探针具有稳定性和高选择性 ．15 2．探针反应与时间和酶浓度呈线性关系 ．．18 3．探针能够检测抑制剂对COMT的抑制作用 20 4．探针检测细胞匀浆中COMT活性 ．．20 5．使用探针细胞成像检测COMT活性 ．．22 6．分子对接模拟 ．．23 7．探针的初步应用 ．24 (四)讨论 26 (五)结论 27 (六)参考文献 ．28 三、综述 34 (一)综述 ．34 (二)参考文献 ．．42 四、攻读学位期间发表文章情况 ．．48 五、致谢 50 万方数据 大连医科大学硕士学位论文一种检测儿茶酚-0-甲基化转移酶荧光探针的设计合成及其 大连医科大学硕士学位论文 一种检测儿茶酚-0-甲基化转移酶荧光探针的设计合成及其 生物应用 硕士研究生姓名：钱星凯 指导教师：秘晓林教授 杨凌研究员 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 COMT(Catech01．0．methyltransferase，儿茶酚．O．甲基转移酶)是人体内一种 重要的的二相代谢酶，可以代谢内源性和外源性儿茶酚类化合物，对机体的防御 也起着重要的作用。COMT的催化功能(即活性)是其在机体发挥功能的前提条 件，COMT催化功能的失常会导致人体多种疾病的发生甚至死亡。因此，评价和 表征COMT催化功能十分重要。基于特异性探针分子检测目标酶催化功能的手段 已得到普遍认同，但现行COMT催化功能表征探针及检测体系受以下条件制约或 有以下缺陷：1．原理上，需要定量检测酶代谢的专一产物，特别是单一产物的生成 量，而不是底物的减少量：2．COMT具有两种形式，在生理状态下底物的选择性并 没有差异，所以对COMT活性的评价是同时评价两种类型COMT的活性：3．COMT 即是膜蛋白也是游离蛋白，其催化功能需要膜结构的完整性或胞浆和辅因子的存 在，反应体系的复杂性影响到不同生物基质或／和内源性物质对COMT催化表征的 稳定性和抗干扰性；4．COMT活性常常需要活细胞水平的检测，因此，底物探针或 者代谢产物不能对活性细胞体系形成毒性伤害；5．已报道的COMT探针底物均为 非荧光底物，未经理性设计和优化，反应检测体系需要借助高效液相色谱．紫外或 高效液相色谱．质谱等大型贵重仪器来实现产物的分离与检测，具有流程繁琐、测 试通量低、成本高、生物基质干扰大等缺陷。 针对上述在选择性、稳定性、灵敏性、抗干扰性、实用性等方面的挑战和限 制，本论文开展了以下工作，1．以高灵敏性和抗干扰性较好的香豆素荧光分子为母 体，构建了4位取代不同，极性大小不同的小分子荧光化合物库8个，最终发现 COMT能够高选择性的将探针DHMC(4-methyl-7，8一dihydroxycoumarin，7,8一二羟 基4-甲基香豆素)甲基化成HMMC(4一methyl一7-hydroxy-8-methoxycoumarin，7- 万方数据 大连医科大学硕士学位论文羟基．8．甲氧基4-甲基香豆素)；2．利用体外重组单酶，系统研究了探针对底物的选 大连医科大学硕士学位论文 羟基．8．甲氧基4-甲基香豆素)；2．利用体外重组单酶，系统研究了探针对底物的选 择性；3．结合COMT偏好的底物结构特征，通过选择香豆素7,8位儿茶酚COMT 代谢的倾向性和代谢选择性，发现COMT选择性代谢8位羟基，只产生一个产物； 4．对COMT荧光底物及其相应甲基化产物的探针性能，包括荧光量子产率、pH稳 定性、激发和发射波长等和COMT酶反应动力学特征进行了系统评估，发现荧光 探针具有很好的稳定性和抗干扰能力；5．将新发现的探针和反应检测体系进行了生 物应用，包括1)人源性组织或生物样本中COMT酶活的定量测定，结果发现COMT 活性检测与传统COMT定量方法结果一致；2)人源性肿瘤细胞中COMT的生物成 像，表明DHMC能够用于体外细胞生物成像，检测细胞中COMT的活性；3)高 通量筛选COMT抑制剂，表明DHMC能够用于高通量筛选CO