抗菌肽三cecropin d的表达 纯化及其体外活性鉴定.docx

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所摘 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 摘 要 抗菌肽是生物体受到外界病原微生物入侵，由特定基因编码产生的一类小分 子多肽。与传统抗生素相比，抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、广谱抗 菌、不易产生耐药性等特点，显示出了良好的临床应用前景。由于抗菌肽在体内 含量低，分离纯化较困难，而化学合成成本较高，难以满足基础研究和临床治疗 的需要，因此，以基因工程的方法制备抗菌肽是一种有效的方法。由于抗菌肽能 够杀伤原核细菌，不宜在原核宿主菌中直接表达，只能采用原核融合表达或在酵 母中分泌表达。本文就抗菌肽Cecropin D的克隆、表达、纯化及其体外的抗菌活 性进行了初步的探讨。 首先，我们根据抗菌肽Cecropin D的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码 子，人工合成了6条寡聚核苷酸片段，经磷酸化、退火、连接及PCR并克隆入表达 载体pThioHisA。优化表达条件后，pThioHisA．eCD在大肠杆菌中获得大量表达， 表达量占菌体蛋白总量的1 5％。经CM．sepharose Fast Flow层析柱纯化后，获得了 90％以上纯度的融合蛋白。融合蛋白pThioHisA—eCD免疫豚鼠，获得抗血清。 接着，我们又选择毕赤酵母偏爱的密码子，采用同样的方法将合成的yCD基 因片段与a因子信号肽连接，并克隆入酵母表达载体pric9K。重组表达质粒 pPIC9K-a．yCD经Sal I线性化后，电转化毕赤酵母宿主菌GSll5，经G418浓度加 压筛选，从200个转化子中筛选到4个高拷贝的转化子。经过PCR鉴定，o【．yCD基 因已经完全整合到酵母基因组中。高拷贝的阳性克隆用0．5％的甲醇诱导表达，表 达上清经CM．sepharose Fast Flow层析柱纯化，Tricine．SDS．PAGE检测，在相对分 子量3．9KD处可见特异性的蛋白条带，且纯化后的目的蛋Cecropin D纯度达90％ 以上，表达量可达21．3mg／L培养液。Western blot分析显示该目的蛋白能够与融合 蛋白pThioHisA．eCD免疫豚鼠获得的抗血清发生特异性的反应。通过琼脂糖扩散 法和比浊法测定表明：Cecropin D在体外具有广谱抗菌活性，对大部分革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。而且抗菌肽Cecropin D在沸水中煮沸30rain 后，抗菌活性仍然不变，说明其具有良好的热稳定性。 总之，本研究成功构建了抗菌肽Cecropin D原核融合表达或酵母分泌表达的 重组表达载体，均获得了高效、稳定的表达，摸索了纯化方案，并在体外对毕赤 1 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 摘要 酵母表达产物Cecropin D的抗菌活性进行了初步的研究，为迸一步研究抗菌肽的 表达水平、抗菌效力及作用机理等提供了基础，也为其大量生产从而开发新型抗 菌药物奠定了一定的基础。 关键词 ：抗菌肽Cecropin D 基因合成大肠杆菌融合表达毕赤酵母 分泌表达 蛋白纯化 抗菌活性 2 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 摘要 Abstract Antibacterial peptides ale a kinds of small molecule peptides．They are produced by specific gene encoding，when organisms are invaded by pathogen outside． Compared to traditional antibiotics，antibacterial peptides have many characteristics including low molecular weight，soluble in water,thermal stability,broad—spectrum antibiotic，difficult to develop drug resistance，and SO on．They show a good clinical application perspective．The naturally occurring antibacterial peptides content in vivo is very low and difficult to isolate．And the cost of chemical synthesis is very hi曲．h is difficult to satisfy demands of basic rese