实验四肝组织中核酸的提取和鉴定.doc

实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定 【目的】 验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。 RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA为核糖，DNA为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 1.磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 【器材】 剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1.生理盐水。 2. 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。 3. 95% 乙醇。 4. 10% NaCl溶液 NaCl 10g溶于蒸馏水中，加至100ml。 5. 0.92 mol/L H2SO4 取浓H2SO4（比重1.84，含量98%）5ml加入蒸馏水中，加水至100ml 。 6. 钼酸铵试剂 钼酸铵3g，溶于70ml蒸馏水中，逐渐加入浓 H2SO4 14ml ，冷却后再加至100ml，混匀备用。 7. 硫酸亚铁试剂 硫酸亚铁10.6g，硫脲5g，加蒸馏水溶解并加水至500ml，冰箱内保存备用。 8. 浓氨水。 9. 0.29mol/L AgNO3 取AgNO3 5g加蒸馏水溶解并稀释至100ml，于棕色瓶避光保存。 10. 3,5二羟甲苯试剂 取浓盐酸100ml，加入FeCl3·6H2O 100mg 及二羟甲苯100mg混匀溶解后，置于棕色瓶中。临用前配制，冰箱保存。（市售3,5二羟甲苯不能直接使用，必须用苯重结晶1～2次，并用活性碳脱色后方可使用）。 11.二苯胺试剂 取1g纯的二苯胺溶于100ml冰乙酸中，加入2.75ml浓硫酸，盛于棕色瓶中，临用前配制。 【操作】 1.核酸的提取与分离： （1）将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中，加入等量的生理盐水，制成匀浆。 （2）将5ml肝匀浆置于离心管内，立即加入0.12mol/L三氯醋酸5ml，用玻棒搅匀，静置8分钟后离心。 （3）倾去上清液，加95% 乙醇5ml，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口，在水浴中煮沸2分钟，冷却后离心。 （4）将离心管倒置于滤纸上，使滤纸吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl溶液4ml，置于沸水浴中加热8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出冷却后再离心。 （5）将上清液倾入另一离心管内，再离心一次，去除可能存在的微量残渣。将上清液倒入烧杯内。 （6）取等量的在水浴中冷却过的95% 乙醇逐滴加入小烧杯内，即可见白色沉淀逐渐析出。静置10分钟后，将小烧杯中沉淀物移入离心管内离心，弃去上清液即得到核酸钠的白色沉淀。 2.核酸的水解 在含有核酸钠的离心管内加入0.92mol/L的H2SO4 4ml，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加热15分钟。 3.核酸组成成分的鉴定 （1）磷酸的鉴定：按下表操作。 表3-3 核酸中磷的鉴定 加入物（滴） 测定管 对照管 核酸水解液 5滴 － 0.92mol/L H2SO4溶液 － 5滴 钼酸铵试剂 3滴 3滴 硫酸亚铁试剂 10滴 10滴 （2）嘌呤碱的鉴定：按下表操作。 表3-4 嘌呤碱的鉴定 加入物（滴） 测定管 对照管 核酸水解液 10滴 － 0.92mol/L H2SO4溶液 － 10滴 浓氨水 数滴（使呈碱性） 数滴（使呈碱性） 0.29mol/L AgNO3 5滴 5滴 观察加入AgNO3后有何变化。静置15分钟后，再比较两管的沉淀. （3）核糖的鉴定：按下表操作。 表3-5 核糖的鉴定 加入物（滴） 测定管 对照管 核酸水解液 4滴 － 0.92mol/L H2SO4溶液 － 4滴 3，5-二羟甲基试剂 6滴 6滴 混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管颜色有何不同。 （4）脱氧核糖的鉴定：按下表操作。 表3-6 脱氧核糖的鉴定 加入物（滴） 测定管 对照管 核酸水解液 10滴 － 0.92mol/L H2SO4溶液 － 10滴 二苯胺试剂 15滴 15滴 混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管有何不同。 【结果及分析】 观察各测定管颜色及沉淀的生成情况，并