植物组织培养基本操作（PPT 97页）.pptVIP

2、表面灭菌 （1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。 （2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机。 （3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。 （4）外植体放入超净工作台内，置70-75%酒精中5-60 秒，0.1氯化汞6-10分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。灭菌时需进行搅动。 表面灭菌剂种类较多，可选取1-2种使用。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 灭菌剂 使用浓度 持续时间 去除的难易 效果 次氯酸钙 9-10％ 5-30分钟 易 很好 次氯酸钠 2％ 5-30分钟 易 很好 氯化汞 0.1-1％ 5-10分钟 较难 最好 抗菌素 4-50mg／L 30-60分钟 中 较好 酒精 70-75% 0.2-2分钟 易 好 过氧化氢 10-12% 5-15分钟 最易 好 三、外植体的接种—无菌接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。 （1）借助接种用工具将材料切割分离。 （2）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角，避免灰尘落入平中。 （3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。 （4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。 （5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。 第四节 外植体的培养 接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。 第二节 培养基的制备 制作一升培养基所需药品20多种，为节省时间和配制的准确，需将各种药品浓缩成一定倍数，并且混合成一定母液，进行保存。制作培养基时根据需求制培养基数量取用母液。 一、培养基母液的配制 （一）营养成分的配制 根据药品性质将母液配制成以下四类： 1、大量元素 可以混在一起配制成10—20倍液，硫酸镁和氯化钙Ca２+和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，要分别单独配制Ca２+与PO4-一起混合易沉淀，定容后消失。 2、微量元素 可配成100—200倍混合母液，KI可单独配。 3、铁盐 硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成100—200倍鳌合剂不易沉淀。 4、有机化合物 维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液，也可分别配制。 （二）植物生长调节物质的配制 植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为0.5－1mg/ml。 1、IAA、NAA： 先用少量95%酒精使之充分溶解。 2、2,4－D： 可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。 3、KT和BA等细胞分裂素类： 先用少量0.1mol/L 的HCl溶解，再用蒸馏水定容至需要的体积。 （三）药品用量的计算： 配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制备容量（L） 二、培养基的制作 （一）母液取用量的计算 制备培养基时母液取用量（ml）=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量（L） （二）培养基制作程序 1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。 2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。 3、向加热容器中加入称量好的琼脂（0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化。 培养基制作程序图 4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖（2-3%），加入加热容器中至溶解。 5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。 6、蒸馏水定容至所需体积。 7、测试培养基溶液的PH值(5.8-6.0)，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。 8、迅速分装到培养瓶中，备用。 培养基是离体培养物赖以生存和生长的人工环境的重要组成部分，常用的培养基依据其物理状态的不同分为固态培养基和液态培养基。 固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。 液态培养基不使用