第十二章 固相膜免疫测定.pptVIP

第十二章　固相膜免疫测定 第一节 概述 一、免疫测定分类 二、免疫测定原理 三、固相免疫测定 四、固相膜的特点 五、常用的固相膜 六、固相膜的技术要求 第二节 免疫金标记技术 一、胶体金的制备 第三节 膜载体免疫测定的种类与原理 一、膜固相免疫测定的特点 二、固相微孔膜测定种类 三、免疫渗滤试验和免疫层析试验 四、酶联免疫斑点试验 五、免疫印迹 六、放射免疫沉淀试验 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。 　第一节 概述 标记免疫测定 放射免疫测定 　 1960’ 酶免疫测定 　　 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 膜固相免疫测定 1990’－ 一、免疫测定分类 二、免疫测定原理 三、固相免疫测定 B与F分离 四、固相膜的特点 多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便 五、常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜 聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜 六、固相膜的技术要求 孔径：0.2~0.6 μm 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 均一性 固相NC膜 第二节　免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。 一、胶体金制备 　胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。 胶体金的制备及特性 胶 体 金（Colloidal Gold）15~60 nm 胶体金结合物（Conjugate） 第三节　膜载体免疫测定的种类与原理 固相微孔膜测定种类 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 一、免疫渗滤测定(IFA) IFA——双抗体夹心法测抗原 IFA——结果判断 二、免疫层析测定（ ICA ） ICA 试剂条 ICA——双抗体夹心法测抗原 ICA——间接法测抗体 ICA 结果观察 IFA与ICA的比较 IFA 穿流（FLOW THROUGH） ICA 横流（LATERAL FLOW） GIFA技术的发展（间接法测抗体） GIFA技术的发展 ICA技术的发展 1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml 合成TnT质控点 半定量测定 三、斑点酶免疫吸附试验 ——Dot-ELISA 四、酶联免疫斑点试验—— ELISPOT 20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked im